Симбиотическая эффективность ризобиальных штаммов Mesorhizobium spp. на эспарцете песчаном Onobrychis arenaria (Kit.) DC. в условиях микровегетационного опыта

В северных регионах Российской Федерации животноводство (северное домашнее оленеводство, молочное животноводство, табунное коневодство и скотоводство) занимает одно из ключевых мест в сельском хозяйстве, а обеспечение животных качественным кормом служит основой его успешного развития (1). Ограниченные площади возделываемых земель, суровый субарктический климат с длительным световым днем и низкими положительными температурами в летний период, а также недостаток доступного азота в почвах накладывает ограничения на применение традиционных кормовых культур, рекомендованных для центральных регионов страны (2). Традиционно основой кормовой базы для животноводства служат многолетние злаковые травы, развитие которых поддерживается внесением азотных удобрений. Однако такие мероприятия могут привести к загрязнению грунтовых вод нитратами и нарушению экологического равновесия (3). В этом контексте все большую актуальность приобретает использование многолетних бобовых культур, способных самостоятельно фиксировать азот благодаря симбиотическим отношениям с клубеньковыми бактериями (ри-зобиями). Применение микробиологических препаратов вместо химических подкормок не только улучшает качество кормов, но и снижает экологическую нагрузку на агроэкосистему (4).

В качестве перспективной бобовой культуры для внедрения в северных регионах России можно выделить эспарцет, который обладает высокими кормовыми качествами (богат белком и конденсированными танинами) и медоносными свойствами (нектаропродуктивность до 200 кг/га), а также служит отличным предшественником для зерновых и технических культур при севообороте благодаря способности обогащать почву азотом (57). На территории России возделывают все три окультуренных вида эспарцета — эспарцет виколистный Onobrychis viciifolia Scop., эспарцет песчаный O. arenaria (Kit.) DC. и эспарцет закавказский O. transcaucasica Grossh.

Эспарцет виколистный — наиболее распространеный культивируемый вид в настоящее время. Он, как и эспарцет закавказский, выращивается в широком диапазоне климатических условий на нейтральных и щелочных почвах с рН 6 или выше, в засушливых и орошаемых районах (8, 9). При этом эспарцет виколистный отличается высоким качеством зеленой массы, а закавказский — лучшей засухоустойчивостью (10-12). Эспарцет песчаный также возделывается в широком географическом диапазоне: в Центрально-Черноземном регионе, Предуралье, Сибири и на Дальнем Востоке (13-15). Он отличается особой зимостойкостью, выдерживая морозы от - 40 до - 45 ° С, что делает его незаменимым для северных условий (16). Для освоения северных регионов перспективны образцы эспарцета песчаного из Сибири, Якутии и европейского Севера России, обладающие высокой зимостойкостью (17). Так, исследования в Якутии показали, что эспарцет сибирский O. arenaria subsp. sibirica (Sirj.) P.W. Ball развивает мощную корневую систему ниже пахотного горизонта мерзлотных почв, что свидетельствует о его хороших адаптационных способностях к экстремальным факторам криолитозоны, таким как короткий вегетационный период, резкие перепады температур и многолетняя мерзлота (18).

Согласно данным литературы, различные виды эспарцета вступают в симбиоз со штаммами родов Rhizobium, Mesorhizobium, Phyllobacterium и Bradyrhizobium из порядка Hyphomicrobiales (ранее Rhizobiales) (19-21). Недавно из клубеньков эспарцета виколистного был выделен и описан новый вид — Mesorhizobium onobrychidis, а также представитель нового рода микросимбионтов Onobrychidicola muellerharveyae (22). Эспарцет способен образовывать эффективный симбиоз с ризобиями, выделенными не только из клубеньков растений-хозяев, но и других бобовых, таких как Oxytropis spp., Astragalus spp., Hedysarum spp. (23, 24), Coronilla spp., Petalostemon spp. и Dalea spp. (25, 26).

В отличие от эспарцета, большинство бобовых культур демонстрируют узкоспециализированный симбиоз в отношении эффективного микросимбионта. Так, клевер ( Trifolium spp.) взаимодействует исключительно с Rhizobium leguminosarum biovar trifolii , а люцерна ( Medicago spp.) — с Ensifer meliloti (27, 28) . Горох ( Pisum sativum L.) и вика ( Vicia spp.) образуют клубеньки с Rhizobium leguminosarum biovar viciae (29). Соя ( Glycine max (L.) Merr) образует симбиоз с Bradyrhizobium japonicum и Bradyrhizobium diazo-efficiens (30). Виды люпина ( Lupinus spp.) также демонстрируют узкую специфичность, взаимодействуя преимущественно с Bradyrhizobium lupini (31).

Эспарцет — это уникальная бобовая культура с низкой специфичностью к широкому кругу видов ризобий, что выделяет ее на фоне других сельскохозяйственных бобовых с узконаправленным симбиозом. Тем не менее работы по изучению биоразнообразия ризобиальных штаммов, способных к нодуляции эспарцета, остаются немногочисленными. Особый интерес представляет поиск и изучение арктических ризобиальных штаммов, выделенных из северных дикорастущих бобовых, способных к эффективной нодуляции растений эспарцета в условиях Крайнего Севера. Исследования в Канаде в 1990-х годах показали, что арктические штаммы клубеньковых бактерий образуют эффективный симбиоз с эспарцетом, превосходящий показатели штаммов из умеренных широт (32). В частности, арктический штамм Mesorhizobium sp. N31, выделенный из астрагала альпийского ( Astragalus alpinus L . ) c полуострова Мелвилл на севере Канады, был изучен в сравнении с коммерческим штаммом Rhizobium sp. SM2 из O. viciifolia умеренных широт.

При формировании симбиоза с эспарцетом виколистным в лабораторных условиях штамм N31 демонстрировал высокую симбиотическую эффективность: нитрогеназная активность при 14 ° C превышала показатели коммерческого штамма в 5,5 раза (50 против 9 C 2 H 4 • ч ^{- 1} • сосуд ^{- 1} на 8-й нед), при 3 ° C — в 2 раза (20 против 10 C 2 H 4 • ч ^{- 1} • сосуд ^{- 1}), при 23 ° C - в 1,4 раза (15 против 11 C 2 H 4 • ч ^{- 1} • сосуд ^{- 1} на 7-й нед). В полевых условиях штамм N31 обеспечивал увеличение урожайности сухой массы на 52,5 % (второй укос 1992 года) по сравнению с контролем без инокуляции и 34,7 % по сравнению с коммерческим штаммом во вторые укосы 1991-1992 годов (33-35).

В настоящей работе впервые выявлена значительная вариабельность симбиотической эффективности штаммов рода Mesorhizobium , выделенных из дикорастущих бобовых в различных географических регионах, при формировании азотфиксирующего симбиоза с эспарцетом песчаным Onobrychis arenaria (K IT .) DC. Установлено, что штаммы северного происхождения демонстрируют повышенную азотфиксирующую активность и положительное влияние на рост растений в микровегетационных условиях. Полученные результаты позволяют рекомендовать ряд штаммов в качестве перспективных инокулянтов для возделывания эспарцета в экстремальных агроклиматических условиях северных регионов России.

Нашей целью было изучение симбиотического потенциала штаммов Mesorhizobium , выделенных из дикорастущих бобовых ( Astragalus , Oxytropis , Hedysarum , Trifolium ) разного географического происхождения, формировать азотфиксирующий симбиоз с культурным бобовым эспарцетом песчаным Onobrychis arenaria (Kit.) DC. в условиях микровегетационного опыта для отбора наиболее перспективных ризобиальных изолятов.

Ìåòîäèêà. Для проведения микровегетационного опыта (МВО, 2025 год) использовали семена эспарцета песчаного и 19 коллекционных бактериальных штаммов рода Mesorhizobium . Штаммы Mesorhizobium (Сетевая биоресурсная коллекция в области генетических технологий для сельского хозяйства, ФГБНУ ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург) были выделены из клубеньков различных видов дикорастущих бобовых Hedysarum , Astragalus , Oxytropis и Trifolium , произрастающих на Камчатке, в арктических и центральных регионах России, в центральной части УССР, а также из популяции культурного бобового O. arenaria (Алтай) и Onobrychis sp. (Армения). Ранее была продемонстрирована способность большинства отобранных штаммов Mesorhizobium формировать эффективный симбиоз с растениями-хозяевами (36-39), а также образовывать клубеньки на корнях эспарцета в условиях предварительного МВО (данные не представлены).

Семена эспарцета скарифицировали и стерилизовали в 98 % растворе серной кислоты (H 2 SO 4 ) в течение 10 мин, после чего дважды промывали стерильной водопроводной водой в течение 15 мин. Эффективность стерилизации контролировали посредством помещения части обработанных семян на чашки Петри с мясопептонным агаром (МПА) и последующей инкубацией при 28 ° С в течение 24 ч. Отсутствие роста микроорганизмов подтверждало стерильность семян.

Семена проращивали на фильтровальной бумаге в стерильных чашках Петри при 25 ° C в темноте в течение 4 сут. Полученные проростки культивировали в стерильных пластиковых стаканах (1000 мл) с крышками, оснащенными бактериальными фильтрами («Duchefa Biochemie», Нидерланды), содержащих 70 г вермикулита. В каждый сосуд добавляли по 100 мл среды Красильникова-Кореняко, содержащей K 2 HPO 4 — 1,0 г/л, MgSO 4 •7H 2 O — 1,0 г/л, Ca 3 (PO 4 ) 2 — 0,2 г/л, FeSO 4 — 0,02 г/л) и 15 мл смеси микроэлементов по Федорову, состоящей из H 3 BO 3 — 0,05 г/л, (NH 4 ) 2 MoO 4 — 0,05 г/л, KCl — 0,005 г/л, NaBr — 0,005 г/л, ZnSO 4 •7H 2 O — 0,003 г/л, MnSO 4 — 0,002 г/л. В стаканах находилось по 5 проростков. В каждый стакан вносили суспензию индивидуальных бактериальных штаммов (10⁶ клеток/мл) в объеме 10 мл. В качестве отрицательного контроля использовали неинокулированные растения.

Растения культивировали в климатической камере (MLR-352H, «PHCbi», Сингапур) в течение 30 сут, при относительной влажности 50 % и следующем режиме освещения (лампы FL40SSW/37, Panasonic, Япония) и температуры: ночь (18 ° C, 8 ч), утро (100 мкмоль/(м² • с ^{- 1}), 20 ° C, 2 ч), день (200 мкмоль/(м² • с ^{- 1}), 23 ° C, 12 ч), вечер (100 мкмоль/(м² • с ^{- 1}), 20 ° C, 2 ч). По завершении культивирования сырую биомассу взвешивали и подсчитывали образовавшиеся клубеньки. Азотфиксирующую активность клубеньков определяли ацетиленовым методом с использованием газового хроматографа GC-2014 («Shimadzu», Япония).

Полученные данные МВО обрабатывали стандартным методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в статистической среде R (версия 4.2.3; R Core Team, 2023). Для каждого из измеряемых симбиотических параметров в каждом варианте инокуляции определяли средние значения ( M ) и стандартные отклонения (±SD). При статистически значимых результатах ANOVA (p < 0,05) проводили тест Дункана для множественного сравнения средних с использованием пакета agricolae.

Ðåçóëüòàòû. Описание 19 коллекционных бактериальных штаммов рода Mesorhizobium , использованных в работе, представлено в таблице 1.

• 1.    Штаммы Mesorhizobium , использованные в работе (лабораторный опыт, 2025 год)

  Оригинальный ¹ штамма	Коллекционный ¹ штамма RCAM	Таксономическая принадлежность	Растение-хозяин	Регион выделения
  572	04779	M. jarvisii	Oxytropis kamtschatica Hult.	Камчатка, РФ
  582	04789	Mesorhizobium sp.
  583	04790	Mesorhizobium sp.
  617	04822	Mesorhizobium sp.	Oxytropis pumilio (Pall.) Ledeb.
  650	04855	Mesorhizobium sp.	Oxytropis anadyrensis Vassilcz.
  699	05097	Mesorhizobium sp.	Astragalus umbellatus Bunge
  705	05101	Mesorhizobium sp.	Astragalus inopinatus Boriss.
  708	05104	Mesorhizobium sp.
  9-4/1	06350	Mesorhizobium sp.	Oxytropis taimyrensis Jurtzev	Якутия, РФ
  25-2/1	06353	Mesorhizobium sp.	Astragalus frigidus (L.) A.Gray
  20/1-4	05519	M. norvegicum	Hedysarum arcticum B.Fedtsch.
  10-1-4	07000	Mesorhizobium sp.	Hedysarum L.	г. Воркута, РФ
  16-2-2	06999	Mesorhizobium sp.	Trifolium lupinaster L.
  Ch33/5-2	07268	Mesorhizobium sp.	Oxytropis maydelliana Trautv.	Чукотка, РФ
  A3-H1	03942	Mesorhizobium sp.	Astragalus L.	Таймыр, РФ
  734	06816	Mesorhizobium sp.	Astragalus cicer L.	г. Полтава, УССР
  787	1413	Mesorhizobium sp.	Hedysarum alpinum L.	г. Москва, СССР
  827	2915	Mesorhizobium sp.	Onobrychis Mill.	Армения
  836	2923	Mesorhizobium sp.	Onobrychis arenaria (Kit.) DC.	Алтай, РФ

• 2.    Эффект инокуляция эспарцета песчаного Onobrychis arenaria (K it .) DC. штаммами Mesorhizobium различного географического происхождения ( n = 5 , M ±SD; лабораторный опыт, 2025 год)

  Регион выделения

  ¹ штамма

  Число клубеньков

  Масса побега, мг

  Масса корней, мг

  Общая масса растения, мг

  Ацетилен-редуктаз-ная активность, мкмоль C 2 H 4 сосуд - 1 сут - 1

  Камчатка	572	3,0±0,71ef	157,0±21,97	153,0±12,04abcd	310,0±33,17ab	0,45±0,09fg
  	582	1,6±0,20h	182,0±19,24	153,0±23,35abcd	335,0±40,62ab	0,1±0,02g
  	583	6,0±1,41a	161,0±25,59	120,0±18,71bcd	281,0±43,65ab	0,02±0.01g
  	617	2,6±0,30ef	184,0±22,19	150,0±27,61abcd	334,0±42,34ab	0,4±0,06fg
  	650	4,4±0,89cd	165,0±16,58	177,0±29,50abcd	342,0±36,16ab	2,8±0,24a
  	699	4,8±0,45bc	202,0±39,62	135,0±18,03abcd	337,0±51,91ab	1,3±0,20cd
  	705	2,0±0,30ef	178,0±7,58	115,0±22,64bcd	293,0±27,97ab	0,6±0,11efg
  	708	1,8±0,45ef	192,0±42,07	193,0±44,81a	385,0±80,23a	0,8±0,11def
  Якутия	9-4/1	3,0±0,40ef	175,0±9,13	128,8±21,75abcd	303,8±28,69ab	0,08±0,01g
  Якутия	20/1-4	3,4±0,55ef	171,0±42,49	176,0±41,74abcd	347,0±79,81ab	2,2±0,30b
  Якутия	25-2/1	5,8±1,10a	180,0±28,28	150,0±24,24abcd	330,0±51,11ab	1,1±0,20de
  г. Воркута	10-1-4	2,6±0,55ef	166,0±25,84	125,0±29,15bcd	291,0±51,04ab	1,1±0,11de
  г. Воркута	16-2-2	4,2±0,45cd	174,0±16,36	142,0±24,14abcd	316,0±36,47ab	0,01±0,00g
  Чукотка	Ch33/5-2	1,8±0,45ef	176,0±27,93	122,0±27,75bcd	298,0±42,07ab	1,1±0,10de
  Таймыр	RCAM03942	3,2±0,45ef	186,0±30,29	119,0±23,82bcd	305,0±50,00ab	1,8±0,23bc
  г. Москва	RCAM1413	3,2±0,45ef	164,0±27,93	161,0±28,37abcd	325,0±45,28ab	0,2±0,03fg
  г. Полтава	RCAM06816	1,6±0,20h	162,0±22,80	135,0±35,88abcd	297,0±48,04ab	0,5±0,10efg
  Алтай	RCAM2923	5,4±0,89ab	164,0±26,08	116,0±10,84bcd	280,0±31,82ab	1,2±0,16cde
  Армения	RCAM2915	3,2±0,45ef	170,0±23,45	192,0±22,8a	362,0±37,68ab	0,07±0,00g
  	Контроль	0,00i	145,0±5,00	113,0±20,49d	258,0±16,05b	0,01±0,00g

Показана способность всех штаммов, использованных в работе, формировать клубеньки на корнях эспарцета, однако параметры симбиоза (число клубеньков, общая биомасса растений и азотфиксирующая активность) варьировали в зависимости от варианта инокуляции (табл. 2).

a-f Разными латинскими буквами отмечены варианты, различия между которыми статистически значимы (p < 0,05). В вариантах без буквенного ранжирования статистически значимых групповых различий (р > 0,05) выявлено не было и тест Дункана не проводился.

Так, наиболее высокую азотфиксирующую активность продемонстрировали штаммы из северных регионов: камчатский изолят Mesorhiz-obium sp. 650 (2,8±0,24), якутский изолят M. norvegicum 20/1-4 (2,2±0,30) и таймырский изолят RCAM03942 (1,8±0,23), выделенные соответственно из O. anadyrensis , H. arcticum и Astragalus sp. Низкие показатели азотфик-сирующей активности были отмечены у армянского изолята RCAM2915

(0,07±0,00), якутского 9-4/1 (0,08±0,01) и камчатского 582 (0,1±0,02). Азотфиксация практически отсутствовала у воркутинского изолята 16-2-2 (0,01±0,00) и камчатского 583 (0,02±0,01).

Интересно отметить, что высокая нодуляционная и азотфиксирую-щая активность штаммов не всегда коррелировали между собой. Так, якутский штамм 25-2/1 и алтайский RCAM2923, сформировавшие статистически значимо большее количество пигментированных клубеньков (соответственно 5,8±1,10 и 5,4±0,89; p < 0,05) в сравнении с остальными вариантами инокуляции, но показали не очень высокую азотфиксирующую активность (1,1 4 ±0,2 и 1,2±0,16), тогда как воркутинский штамм 16-2-2 и камчатский штамм 583 при активной нодуляции (4,2±0,45 и 6,0±1,41) сформировали соответственно неэффективные и малоэффективные клубеньки. При этом клубеньки, сформированные двумя последними штаммами, были не-пигментированными, характеризовались небольшими размерами и округлой формой, что также указывало на отсутствие физиологической активности.

Влияние штаммов на развитие растений также варьировало. В частности, общая биомасса, достоверно превышающая контроль, наблюдалась у растений, инокулированных камчатским штаммом 708 (385,0±80,23 мг; p < 0,05), при этом его нодуляционная и азотфиксирующая активность были относительно низкими (соответственно 1,8±0,45 и 0,8±0,11).

Интересно отметить, что штамм Mesorhizobium sp. RCAM2915, несмотря на очень низкую азотфиксирующую активность (0,07±0,00), показал относительно высокие значения общей биомассы (362,0±37,68 мг), хотя статистически значимых различий с другими инокулированными вариантами не наблюдалось. Это может свидетельствовать о наличии дополнительных механизмов стимуляции роста растений, возможно, через продукцию фитогормонов. Известно, что ризобии способны стимулировать рост растений независимо от их азотфиксирующей активности (40). Ключевым механизмом такой стимуляции становится синтез фитогормонов — индол-3-ук-сусной кислоты, цитокининов и гиббереллинов, которые регулируют клеточное деление, дифференциацию и растяжение клеток растений (41-44). Кроме того, многие штаммы Mesorhizobium spp. обладают геном acdSR и продуцируют фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК)-дезами-назу, который расщепляет АЦК (непосредственный предшественник этилена в растениях) до аммиака и α -кетобутирата, тем самым снижая содержание этилена, ингибирующего рост растений при стрессе (45, 46). Также ризобии могут улучшать поглощение питательных веществ через солюбилизацию фосфатов и продукцию сидерофоров (47-50).

Географическое происхождение штаммов оказывало заметное влияние на параметры бобово-ризобиального симбиоза. Изоляты из северных регионов демонстрировали более высокую азотфиксирующую активность по сравнению со штаммами из умеренных широт: камчатский штамм 650 (2,8±0,24 мкмоль C 2 H 4 сосуд ^{- 1} сут ^{- 1}), якутский 20/1-4 (2,2±0,30) и таймырский RCAM03942 (1,8±0,23) значительно превосходили штаммы RCAM1413 из Московской области (0,2±0,03), RCAM06816 из Полтавы (0,5±0,10) и RCAM2915 из Армении (0,07±0,00). Все инокулированные варианты оказали положительное влияние на развитие растений, однако статистически значимое увеличение массы корней по сравнению с контрольной группой наблюдалось у камчатского штамма 708 и армянского RCAM2915 (193,0±44,81 и 192,0±22,80; p < 0,05). При этом камчатский штамм 708 также способствовал достоверному увеличению общей сырой биомассы растений.

На основании комплексной оценки симбиотической эффективности таймырский штамм RCAM03942, якутский 20/1-4, а также камчатские штаммы 650 и 708 можно рекомендовать для дальнейшего изучения в качестве перспективных микробных инокулянтов эспарцета с последующей валидацией их эффективности в экстремальных агроклиматических условиях северных регионов России.

Следует отметить, что фундаментальный и практический интерес представляет изучение молекулярно-генетических механизмов низкой (не свойственной культурным бобовым) специфичности эспарцета песчаного к широкому кругу микросимбионтов. Решение этого вопроса позволит повысить восприимчивость сельскохозяйственных бобовых к нетипичным для них штаммам эффективных ризобий и расширить географические пределы возделывания многих традиционных бобовых культур. Направленная оптимизация симбиотических систем на основе штаммов, адаптированных к определенным климатическим условиям, может способствовать повышению эффективности растительно-микробных взаимодействий и улучшению агрономических характеристик эспарцета песчаного для широкого внедрения этой ценной бобовой культуры на территории российских регионов с различными почвенно-климатическими условиями.

Таким образом, результаты микровегетационного опыта продемонстрировали значительную вариабельность симбиотической эффективности штаммов Mesorhizobium при взаимодействии с эспарцетом песчаным. Наибольшую азотфиксирующую активность показали северные штаммы Mesorhizobium sp. 650, 20/1-4, RCAM03942, выделенные из дикорастущих бобовых Oxytropis anadyrensis , Hedysarum arcticum и Astragalus sp . , соответственно, тогда как штаммы Mesorhizobium sp. 708 RCAM2915, выделенные из Astragalus inopinatus и Onobrychis sp., способствовали увеличению общей сырой биомассы растений и корней по сравнению с остальными вариантами инокуляции. Выявлена тенденция к повышенной азотфиксирующей активности у штаммов северного происхождения по сравнению со штаммами из умеренных широт. Большинство исследованных штаммов оказали положительное влияние на развитие растений, однако статистически значимое увеличение сырой биомассы по сравнению с контрольной группой без инокуляции наблюдалось только у камчатского штамма Mesorhizobium sp. 708. В дальнейшем эффективность бобово-ризобиального симбиоза между штаммами Mesorhizobium и растениями эспарцета песчаного будет оценена в условиях микровегетационного опыта при пониженных температурах, что позволит отобрать наиболее перспективные штаммы для их последующего изучения в условиях многолетних полевых опытов в различных регионах России.

ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии ,