Синэкологический анализ микробиоценозов крупных птицеводческих хозяйств

быть носителями многих зоопатогенных микроорганизмов, вызывающих острую кишечную инфекцию (ОКИ) у людей, таких как Escherichia coli, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus , а также эпидемиологически опасной кишечной микрофлоры, среди которых ведущие – Salmonella enteritidis (возбудитель сальмонеллеза) и Campylobacter jejuni (возбудитель кампилобактериоза) [2]. То есть, изучение микробиоценозов в данном случае является частью мероприятий по созданию эпидемиологического благополучия на птицефабрике, что должно способствовать производству высококачественной продукции, свободной от эпидемиологически опасной условно-патогенной микрофлоры. Однако, экологические особенности синэкологической структуры микробиоценозов в крупных птицеводческих хозяйствах остаются практически неисследованными.

Цель работы: выявление особенностей видовой структуры сообществ микроорганизмов, циркулирующих среди персонала и поголовья птицы в трех крупных птицеводческих хозяйствах Нижегородской области.

В этой работе мы впервые при помощи статистических методов и экологических индексов установили различие в видовом составе сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки персонала цехов крупных птицеводческих хозяйств и микробиоты кур.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Микробиоценозы изучали с помощью оптимизированного авторами классического бактериологического метода, позволяющего выделить широкий спектр видов микроорганизмов и идентифицировать их с примененим время-пролетного MALDI масс-спектрометра Autoflex (Bruker Daltonics, Германия) [3].

Была изучена микрофлора толстой кишки 223 сотрудников трех птицефабрик, непосредственно контактирующих с курами: птичницы, работники кормоцехов, сотрудники убойного цеха. Кроме того, исследованы микробиоценозы органов и систем 277 птиц: сердце, селезенка, зоб, желудок, желчный пузырь, тонкая и толстая кишка, яичники, лимфатические узлы, мозг. Всего проведено более 2000 исследований.

Результаты микробиологического исследования (видовая представленность и численность каждого вида микроорганизмов в 1г субстрата) внесены в сформированную ранее базу данных и распределены по 29 группам-показателям, наиболее полно отражающим структуру микробиоценозов человека и животных. Внесенные записи систематизированы и обработаны с помощью созданной нами системы управления базой данных (СУБД) «Автоматизи- рованная система микробиологического мониторинга микробиоценозов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)» [4].

Статистический анализ полученных результатов проводили с применением статистических критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка, а также непараметрических критериев Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса. Для расчетов использовали разработанную нами «Автоматизированную систему микробиологического мониторинга микробиоценозов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)» и программу STATISTICA 8.0 (StatSoft) [5,6]. Критическое значение р-уровня принимали равным 0,05 [4,6].

Экологический анализ перестройки видовой структуры (видового богатства и видового разнообразия) сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки людей и кишечника кур был проведен с применением индексов сходства (Жаккара и Коха), экологических индексов Шеннона, Симпсона, Маргалефа и Пиелу [3, 7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе статистического анализа была проведена процедура проверки общей матрицы данных на нормальность распределения с помощью критериев Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка. Анализ показал, что данные не подчиняются нормальному распределению. В связи с этим в дальнейшем использовали непараметрические статистические методы [6-8].

Статистический анализ различий в численности представителей кишечной микрофлоры людей, работающих на птицефабриках, был проведен с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Анализ проводился между сотрудниками, работающими на двух птицефабриках: птицефабрика А и птицефабрика В. В анализ были включены 15 показателей, одновременно встречающихся у людей в двух птицефабриках. Установлено, что статистически значимые различия между двумя исследованными птицефабриками наблюдались по пяти видам микрофлоры кишечника людей: Lactobacillus spp., Escherichia coli лактозопозитивная, E. coli (всего), Staphylococcus epidermidis и Klebsiella spp. (табл. 1).

Статистический анализ различий в численности представителей микробиоты кур трех птицефабрик был проведен с помощью непараметрического критерия Крускалла-Уоллиса [6,7]. В анализ были включены 9 показателей, одновременно встречающихся у кур на трех птицефабриках. Было установлено, что статистически значимые различия между тремя исследованными птицефабриками наблюдались по шести видам микробиоты кур: Salmonella spp., Lactobacillus spp., E. coli (всего), Staphylococcus epidermidis, Klebsiella spp., Enterobacter spp. (табл. 2).

Таблица 1. Различия в численности видов микроорганизмов микробиоты сотрудников цехов птицефабрик А и В (по критерию Манна-Уитни)

№ п/п	Виды микроорганизмов	Уровень значимости (р )
1	Bifidobacterium spp.	0,053
2	Lactobacillus spp.	0,013
3	Lactococcus spp.	0,803
4	E. coli лактозопозитивные	<0,001
5	E. coli лактозодефективные	0,852
6	E. coli лактозонегативные	0,137
7	E. coli гемолитические (способность к гемолизу как фактор патогенности)	0,930
8	E. coli (всего)	0,043
9	Enterococcus spp..	0,142
10	Staphylococcus epidermidis	<0,001
11	Staphylococcus aureus	0,123
12	Klebsiella spp..	0,042
13	Citrobacter spp..	0,999
14	Proteus mirabilis	0,999
15	Morganella morganii	0,999
Кол-во статистически значимо различающихся показателей, абс. (%)		5(31)

Таблица 2. Различия в численности видов микроорганизмов микробиоты кур птицефабрик А , В и С (по критерию Крускалла-Уоллиса)

№ п/п	Показатели	Уровень значимости (р )
1	Lactobacillus spp.	0,002
2	E. coli лактозопозитивные	0,060
3	E. coli лактозонегативные	0,142
4	E. coli (всего)	0,033
5	Staphylococcus epidermidis	<0,001
6	Klebsiella spp.	0,031
7	Enterobacter spp., Pantoea spp.	0,041
8	Proteus mirabilis	0,999
9	Salmonella spp.	<0,001
Кол-во статистически значимо различающихся показателей, абс. (%)		6 (56)

Таким образом, с применением критерия Крускалла-Уоллиса выявлено наличие статистически значимых различий в численности только определенных видов микроорганизмов.

Для ответа на вопрос о наличии или отсутствии различий в численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки сотрудников и микробиоты кур, относящихся к одной птицефабрике, был проведен статистический анализ попарных различий с применением непараметрического критерия Манна–Уитни. В анализ были включены 11 видов симбиотических микроорганизмов, встречающихся одновременно у людей и кур птицефабрики А и 12 видов птицефабрики В.

В ходе анализа в каждой птицефабрике были выявлены виды микроорганизмов, которые статистически значимо различались по численности между сотрудниками и курами (табл. 3).

Экологический анализ перестройки видовой структуры (видового богатства и видового разнообразия) сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки людей и кишечника кур был проведен с применением индексов сходства (Жаккара и Коха) и экологических индексов Шеннона, Симпсона, Маргалефа и Пиелу [3,7].

На начальном этапе с использованием коэффициента Жаккара ( Cj ) было проведено изучение сходства в видовом составе микробиоценоза толстой кишки сотрудников птицефабрик A, B. Анализ показал, что у сотрудников коэффициент сходства Жаккара составляет 0,71. Довольно высокий уровень сходства объясняется тем, что состав микробиоценоза кишечника (ядро микробиоты) человека относительно постоянен, несмотря на влияние различных факторов внешней среды (климат, питание и др.) [9].

Аналогичное изучение сходства видово- го состава микробиоценоза кур показало, что в этом случае коэффициент сходства Жаккара находится в неперекрывающемся с сотрудниками интервале 0,44÷0,61. С помощью индекса биотической дисперсии Коха (Ik) было оценено сходство видового состава микробиоценоза кишечника кур птицефабрик А, В и С, участвующих в анализе. Значение индекса Коха составило 0,51. Сравнительно низкий уровень сходства видового состава микробиоты кур объясняется разными условиями содержания птицы (на птицефабриках А и В напольное содержание, на птицефабрике С – клеточное), использованием разных кормов, воды, а также тем, что птицефабрики являются для кур «замкнутой» системой, в которой они находятся в течение всего жизненного цикла.

Анализ сходства видового состава микробиоты кур и толстой кишки сотрудников цехов птицефабрик А и В с помощью коэффициента Жаккара ( Cj ) показал среднюю степень видового сходства (52%; С _J -0,52 ) между сравниваемыми группами (табл. 4).

Таблица 3. Статистически значимые численности видов микроорганизмов (показатели), выявленные при попарном сравнении видовой структуры микробиоты сотрудников и кур каждой птицефабрики (по критерию Манна-Уитни)

№п/п	Птицефабрики	Виды	Значение р-уровня
1.	Птицефабрика - племенной завод А	Bifidobacterium spp..	<0,001
		Lactobacillus spp..	0,004
		E. coli	0,002
		Enterococcus spp.	<0,001
		E. coli (всего).	0,002
		Proteus mirabilis	<0,001
2.	Птицефабрика В	Lactobacillus spp.	0,001
		Citrobacter spp..	0,009
		E.coli лактозопозитивная.	0,002
		Enterobacter spp.	0,003
		Pantoea spp.	0,002
		Klebsiella spp .	0,001

Таблица 4. Сходство видового состава сообществ симбиотических микроорганизмов микробиоты кур и сотрудников цехов птицефабрик А и В, оцениваемое коэффициентом Жаккара

Показатели	Птицефабрика А	Птицефабрика В
Коэффициент Жаккара	0,52	0,52
Число общих видов микроорганизмов	11	12

Синэкологический анализ предполагает анализ видовой структуры сообщества, которая характеризуется не только показателями видового богатства, но и видового разнообразия, учитывающего представленность каждого вида. Левич [10] подчеркивает, что видовая структура представляет собой экологическую «систему отсчета», поскольку именно изменения в численностях видов дают информацию о структуре и функционировании сообщества. Удобной формой свертывания информации о сообществе представляют собой экологические индексы: видового разнообразия Шеннона, доминирования Симпсона, видового богатства Маргалефа и выравненности Пиелу [10-14] (табл. 5).

Следует подчеркнуть, что во всех птицефабриках, как у кур, так и персонала цехов при увеличении видового разнообразия сообществ симбиотических микроорганизмов, оцениваемого по индексу Шеннона, закономерно снижается доминирование (индекс Симпсона) и возрастает выравненность (индекс Пиелу) (табл. 5). Эти факты полностью согласуются с основными положениями теоретической экологии.

В табл. 6 показан анализ видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки сотрудников цехов и микробиоты кур птицефабрик. Сравнение видового богатства микробиоты кур птицефабрик А, B и С показало, что в трех исследуемых птицефабриках присутствуют 12 общих видов микроорганизмов: Escherichia coll (всего), Lactobacillus spp, E. coll (лак+), Staphillococcus epidermidis , Klebsiella spp , Enterobacter spp., Pantoea spp., E. coli (лак-), Salmonella spp (S.enteritidis) , микроорганизмы группы неферментирующих грамотрицатель-ных бактерий, Proteus mirabilis .

Сравнение видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки персонала цехов птицефабрик А , B показало, что в двух сравниваемых группах присутствуют 13 общих видов микроорганизмов: E.coli (лак+), B ifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Enterococcus spp., E.coli (всего), Citrobacter spp., Staphylococcus epidermidis, E.coli гемолитические (способность к гемолизу как фактор патогенности), Klebsiella spp., E.coli (лак-), Proteus mirabilis, E.coli лактозодефективные, Staphylococcus aureus .

Таблица 5. Показатели видовой структуры сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки сотрудников цехов и микробиоты кур птицефабрик

Показатели	Формула (обозначение)	Куры			Работники
		< Cti Ч К О s CQ XO m rti 1S -в- о cu К o' a S cu £ S С о C	m rti S xo rti ■e cu O' S C	и rti S xo rti ■e cu S C	< 1   4 rti O CQ S rti n , co XO э2 rti o -e a cu щ er S g S c	m rti S xo rti ■e cu CT S C
Общая численность	N•109	82,61	0,97	0,042	138,84	176,51
Видовое богатство	S	16	15	14	16	19
Индекс видового разнообразия Шеннона	H Z) A vp 1 =	0,14	0,17	1,39	1,48	1,19
Индекс доминирования Симпсона	S C = Z p- i =1	0,95	0,94	0,32	0,29	0,47
Индекс видового богатства Маргалефа	л S -1 d =--- In N	3,40	4,96	4,09	3,04	3,67
Индекс выравненности Пиелу	e = H /In S	0,05	0,06	0,53	0,53	0,39

Таблица 6. Сравнительный анализ видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки сотрудников цехов и микробиоты кур птицефабрик

	А	B	C	Общие виды
Куры	16	15	14	10
Персонал цехов	16	19	-	13
Общие виды	12	11	-

Наличие Salmonella enteritidis в микробиоте кур и отсутствие этих микроорганизмов в микробиоценозе толстой кишки персонала можно объяснить тем, что в условиях постоянного инфицирования малыми дозами сальмонелл у работников птицеводческих хозяйств вырабатывается специфические сальмонеллезные антитела в высоких титрах, препятствующие появлению в микробиоте этих бактерий [15].

Сравнение видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки персонала цехов птицефабрики А и микробиоты кур птицефабрики А показало, что в двух сравниваемых группах присутствуют 12 общих видов микроорганизмов: E.coli (всего), Enterococcus spp., Lactobacillus spp., E.coli (лак+), Bifi dobacterium spp., Staphylococcus epidermidis, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, E.coli (лак-), Proteus mirabilis , Дрожжевые клетки – дрожжеподобные грибы, не относящиеся к роду Candida ( Saccharomyces spp., Kluiveromyces spp., Picchia spp. и др.), E.coli лактозодефективные.

Сравнение видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки персонала цехов птицефабрики B и микробиоты кур птицефабрики B показало, что в двух сравниваемых группах присутствуют 11 общих видов микроорганизмов: E.coli (всего), Enterococcus spp., Lactobacillus spp., E.coli (лак+), Bifi dobacterium spp., Staphylococcus epidermidis, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, E.coli (лак-), Proteus mirabilis , E.coli лактозодефективные.

Таким образом, проведенный анализ результатов бактериологических исследований, проведенный c помощью общепринятых статистических критериев и экологических индексов, позволил сделать следующие выводы:

ВЫВОДЫ

Выявлены статистически значимые различия в численности видов микроорганизмов микробиоты кишечника сотрудников птицефабрик А, В: Lactobacillus spp., E. coli (лак + и всего), Klebsiella spp., S. epidermidis ; и микробиоты кур птицефабрик А, В, С: Lactobacillus spp., E. coli (всего), Salmonella spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., S. epidermidis.

В каждой из двух птицефабрик (А, В) выявлены статистически значимые различия в чис- ленности видов микроорганизмов микробиоты кишечника сотрудников и микробиоты кур.

Анализ сходства в видовом составе микробиоценоза толстой кишки сотрудников птицефабрик A, B показал, что у сотрудников коэффициент сходства Жаккара составляет 0,71. Достаточно высокая степень сходства говорит о том, что состав микробиоценоза кишечника (ядро микробиоты) человека относительно постоянен, несмотря на влияние различных факторов внешней среды (климат, питание и др.).

Анализ сходства в видовом составе микробиоценоза кур птицефабрик А, B установил, что коэффициент сходства Жаккара находится в не-перекрывающемся с сотрудниками интервале 0,44÷0,61, оценка сходства в видовом составе микробиоты кур трех птицефабрик A, B, C при помощи индекса биотической дисперсии Коха показала низкий уровень сходства видового состава микробиоты (0,51). Это может объясняться разными условиями содержания птицы (на птицефабриках А и В напольное содержание, на птицефабрике С – клеточное), использованием разных кормов, воды, а также тем, что птицефабрики являются для кур «замкнутой» системой, в которой они находятся в течение всего жизненного цикла.

Анализ сходства видового состава микробиоты кур и толстой кишки сотрудников цехов птицефабрик А и В с помощью коэффициента Жаккара ( Cj ) установил среднюю степень видового сходства (52%; С _J -0,52) между сравниваемыми группами.

Синэкологический анализ показал, что во всех птицефабриках, как у кур, так и персонала цехов при увеличении видового разнообразия сообществ симбиотических микроорганизмов, оцениваемого по индексу Шеннона, закономерно снижается доминирование (индекс Симпсона) и возрастает выравненность (индекс Пиелу).

Проведенный анализ видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов микробиоты сотрудников птицефабрик и кур выявил наличие 12 общих видов по птицефабрике А и 11 общих видов по птицефабрике В.

Salmonella enteritidis была выделена только из микробиоты кур на всех птицеводческих площадках.