Синтетические монофенольные антиоксиданты активируют аутофагию в опухолевых клетках: зависимость от структуры и концентрации

DOI:

ББК 52.5

СИНТЕТИЧЕСКИЕ МОНОФЕНОЛЬНЫЕ АНТИОКСИДАНТЫ АКТИВИРУЮТ АУТОФАГИЮ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ: ЗАВИСИМОСТЬ ОТ СТРУКТУРЫ И КОНЦЕНТРАЦИИ

Елена Брониславовна Меньщикова

ФИЦ фундаментальной и трансляционной медицины, г. Новосибирск, Российская Федерация

Антон Владимирович Чечушков

ФИЦ фундаментальной и трансляционной медицины, г. Новосибирск, Российская Федерация

Петр Михайлович Кожин

ФИЦ фундаментальной и трансляционной медицины, г. Новосибирск, Российская Федерация

Сергей Викторович Хольшин

Новосибирский государственный педагогический университет, г. Новосибирск, Российская Федерация

Наталья Валерьевна Кандалинцева

Новосибирский государственный педагогический университет, г. Новосибирск, Российская Федерация

Григорий Григорьевич Мартинович

Белорусский государственный университет, г. Минск, Республика Беларусь

Николай Константинович Зенков

ФИЦ фундаментальной и трансляционной медицины, г. Новосибирск, Российская Федерация

Введение. Активированные кислородные метаболиты (АКМ) в нормальных условиях являются важными регуляторами биологических процессов, однако часто, особенно при патологических процессах, их гиперпродукция приводит к развитию окислительного стресса [2]. Для поддержания низкого уровня АКМ в клетках служит многоуровневая система эндогенных и экзогенных антиоксидантов. Последние наиболее широко представлены фенольными соединениями, помимо непосредственного антирадикального эффекта способными оказывать непрямое защитное действие при окислительном стрессе, в том числе благодаря способности индуцировать аутофагию [4; 6].

Одним из наиболее неоднозначных патологических состояний в плане изменения редокс-баланса и перспектив фармакологического воздействия на него относится опухолевый рост. Целью настоящего исследования послужило изучение зависимости между структурой оригинальных синтетических мо-нофенольных антиоксидантов и их способностью влиять на активность аутофагии в опухолевых клетках.

Материал и методы. По описанной ранее [1; 3] последовательности превращений синтезированы четыре оригинальных гидрофильных фенольных соединения структурно взаимосвязанного ряда: 3-(3'-трет-бутил-4'-гид- роксифенил)этилтиосульфонат натрия (ТС-12), 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтио-сульфонат натрия (ТС-13), 3-(3',5'-ди-трет-бу-тил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-17) и 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифе-нил)пропилсульфонат натрия (С-13); их строение подтверждали данными элементного анализа, ЯМР-, ИК- и УФ-спектроскопии. Выраженность аутофагии в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 оценивали с помощью визуализации внутриклеточных везикул, позитивных по маркеру LC3B (аутофагосом), на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM 710. Фармакологическое воздействие на клетки осуществляли в течение 24 ч; для сравнения выраженности образования аутофагосом и скорости их лизосомальной деградации каждую точку дублировали экспериментом с добавлением в культуральную среду помимо тестируемого соединения хлорохина в концентрации 60 мкМ за 1 ч до выведения из эксперимента. В ходе непрерывного процесса аутофагии LC3B-по-зитивные везикулы постоянно деградируют в лизосомах; добавление хлорохина блокирует аутофагосомально-лизосомальное слияние, а наблюдаемое при этом количество аутофагосом отражает интенсивность их формирования. Соотношение количества аутофагосом в группах с хлорохином и без него (коэффициент kCQ) отражает способность клеток удалять вновь формирующиеся аутофагосомы [5], будучи важным показателем защитных свойств аутофагии. Изображения анализировали и обрабатывали с помощью программы CellProfiler: сегментировали ядра клеток по маркеру DAPI, затем для выделения клеток сегментировали сигнал от LC3B, ассоциированный с каждым ядром, разделяли каждый объект на цитоплазматический и ядерный компартменты и накладывали полученные контуры на исходное изображение с целью сегментирования везикул и их ассоциации с цитоплазматическими компар-тментами, для которых собирали данные о суммарной и средней интенсивности флуоресценции флуорохрома, отражающей количество белка LC3B. Данные представлены в виде медианы и межквартильных интервалов, для оценки различий использовали критерии Манна – Уитни и Данна.

Результаты. Для контрольных клеток наблюдалось характерное различие в количестве детектируемых аутофагосом при воздействии хлорохином и без него (рис., а). Исследованные соединения, за исключением ТС-13, в концентрации 5 мкМ несколько снижали скорость формирования новых аутофагосом (группа с хлорохином, рис., а) и темпы удаления образовавшихся аутофагосом (коэффициент kCQ, рис., б), в то время как при инкубировании клеток MCF-7 в присутствии 20 мкМ соединений последний показатель неизменно увеличивался, сравниваясь с контролем (ТС-12) либо превышая его (ТС-13, С-13); для соединения ТС-17 (полностью экранированного монофенола) отмечаются низкие показатели удаления аутофагосом, что отражается в уменьшении коэффициента kCQ.

Таким образом, можно заключить, что установленная нами ранее способность новых водорастворимых монофенольных антиоксидантов, различающихся количеством трет -бутильных заместителей и строением пара -алкильного заместителя ОН-группы, угнетать жизнеспособность опухолевых клеток линии MCF-7 [1], обусловлена в том числе активацией аутофагии; эффект зависит от структуры и концентрации соединения.