Система бета-глюкуронидазы, кишечная микрофлора и развитие опухолей толстой кишки

DOI:

Рак толстой кишки (колоректальный рак, колоректальная карцинома, CRC) является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей человека с тенденцией к возрастанию числа заболеваний и смертельных случаев во многих странах мира. Показатели заболеваемости у мужчин выше, чем у женщин с примерной 1,4-кратной и 1,5-кратной разницей по заболеваемости (23,6 против 16,3 случая на 100 000 человек в год) и смертности (10,8 против 7,2 случаев смерти на 100 000 человек в год) соответственно. Данные показатели связаны с тем, что мужчины являются подверженными влиянию окружающих факторов больше, чем генетическим, по сравнению с женщинами, при этом наследственность CRC для женщин составляет 45 %, а для мужчин – 28 % [9; 10].

Риск развития CRC увеличивается после 50 лет, при этом 90 % случаев заболевания регистрируются именно у лиц старше этого возраста. Помимо возраста, основными факторами риска возникновения CRC являются наличие случаев заболевания в семье, ожирение, сахарный диабет, малоподвижный образ жизни, курение, высокое потребление алкоголя, принятие пищи с высоким содержанием жиров и низким содержанием клетчатки. 42

Более 75–95 % случаев рака толстой кишки встречаются у пациентов с незначительными или отсутствующими генетическими отклонениями [33; 35].

Люди с воспалительным заболеванием кишечника, таким как язвенный колит и болезнь Крона, подвержены высокому риску CRC, который тем выше, чем больше длительность воспалительной патологии. У людей с болезнью Крона было выявлено до 2 % новых случаев CRC через 10 лет, 8 % – через 20 лет и 18 % – через 30 лет [33].

С точки зрения этнических различий наиболее подверженными заболеванию являются чернокожие, а менее подверженными выходцы из Азии и островов Тихого океана. Это справедливо как в отношении заболеваемости (43,2 против 28,8 случаев на 100 000 человек в год), так и смертности (18,6 против 9,9 случаев смерти на 100 000 человек в год). В данном различии могут играть роль генетические факторы, например, у чернокожих было найдено несколько однонуклеотидных полиморфизмов, связанных с риском CRC [18; 26].

Значительная роль принадлежит низкой информированности населения о факторах риска и их профилактике, а также о ранней диагностике CRC. Так, в 2018 г. в США лишь 65,2 % взрослых в возрасте 50–75 лет были в курсе скрининга CRC (тремя годами ранее – 47,4 %). Но среди индейского населения, латиноамериканцев и выходцев из Азии величина показателя находилась в пределах 55–57 %, а среди лиц без медицинской страховки – только 29,7 % [8; 36].

Участие микрофлоры в образовании рака толстой кишки

Кишечная флора, эпителиальные клетки слизистой оболочки, пищевые пробиотические компоненты и малые молекулы – включая гормоны, ферменты, слизь и желчные соли – составляют сложную кишечную микроэкосистему, которая является устойчивой системой в физиологических условиях [32; 42].

В этом обзоре мы обобщаем известные данные о влиянии кишечной микробиоты на фенотип CRC, описываем факторы, которые способны повлиять на состав кишечной микробиоты и показываем стратегии, которые могут быть применены в экспериментальных проектах, с учетом влияния микробиоты на развитие CRC. Тщательное планирование на основе вышесказанного, будет способствовать продвижению исследований, направленных на профилактику и лечение CRC [20].

Механизм углеводного обмена играет важную роль в развитии CRC. Во-первых, кислород участвует в углеводных метаболичес- ких путях, а СО2 и H2O основами метаболитами углеводного обмена, и они связаны с развитием CRC [22; 37; 42]. Во-вторых, АТФ вырабатывается во время углеводного обмена и снабжает все живые клетки энергией. Фосфорибоза, образующаяся при метаболизме пентозофосфата, необходима для синтеза ДНК и РНК, а это в свою очередь является основным компонентом для быстрой пролиферации бактериальных и раковых. В-третьих, НАДФН является промежуточным метаболитом, который участвует в фосфорилировании белков и генов, и может быть вовлечен в микробную изменчивость и эпигенетическую регуляцию CRC. В-четвертых, митохондрии являются ключевым местом для углеводного обмена, а митохондриальная дисфункция является одной из наиболее важных особенностей при CRC и дисбалансе кишечной флоры [32].

Высокое содержание жиров способствует развитию CRC, так как происходит увеличение секреции желчи и желчных кислот в толстой кишке, а некоторые клостридии могут ускорять превращение желчной кислоты во вторичные кислоты с канцерогенным действием (рис. 1) [30]. Аминокислотный обмен также играет роль в канцерогенезе. Многие токсичные вещества, такие как сера, нитраты, сероводород, аммиак и амины, образуются под влиянием аминокислотного обмена и могут привести к развитию CRC [9; 31].

Рис. 1. Окисление таурина в Bilophila wadsworthia

Примечание. Процесс проходит в 3 ферментативных этапа. Вначале таурин трансанимируется с помощью фермента таурин:пируватаминотрансферазы с получением аланина и сульфоацетальдегида. Затем сульфоацетальдегид под действием сульфоацетальдегид-сульфолиазы с образованием ацетата и сульфата. На последнем этапе сульфат восстанавливается диссимиляционной сульфитредуктазой до сероводорода с использованием электронных доноров, таких как водород и формиат. Для завершения цикла аланин превращается обратно в пируват с помощью аланин-дегидрогеназы [30].

К настоящему времени, за более, чем 50летний период изучения участия кишечной микрофлоры в развитии опухолей данной локализации, приведено достаточно большое число доказательств того, что микроорганизмы кишечника играют ключевую роль в канцерогенезе. Среди представителей микрофлоры по значимости в возникновении и прогрессировании CRC играют такие виды, как как Bacteroides, Escherichia, Fusobacterium и Porphyromonas [13–15; 40].

Кроме того, было обнаружено, что численность некоторых видов, таких как F. nucleatum и Solobacterium moorei , была увеличена на ранней и поздней стадии развития рака, а некоторых, таких как Atopobium parvulum и Actinomyces odontolyticus , только на ранней, что может быть потенциально использовано в качестве биомаркеров для ранних аденоматозных поражений [12]. Некоторые специфические бактерии, такие как Bacteroides fragilis , Streptococcus bovis , Escherichia coli , Enterococcus faecalis и Streptococcus gallolyticus , очень тесно связаны с CRC [14; 15; 17]. Недавние исследования на людях выявили новые штаммы бактерий, участвующие в CRC канцерогенезе, к ним относятся бактерии таких родов, как Parvimonas , Peptostreptococcus , Porphyromonas и Prevotella , а также Fusobacterium nucleatum [23; 24; 29; 41].

Роль β-глюкуронидазы при раковых заболеваниях

β -глюкуронидаза относится к семейству гликозидаз, стимулирующих расщепление сложных углеводов. Глюкуронидаза человека, находящаяся в лизосоме, катализирует остаток d-глюкуроновой кислоты из не восстанавливающего конца гликозаминогликанов, например гепарансульфата. В кишечнике она превращает конъюгированный билирубин в не конъюгированную форму для реабсорбции. в-глю-куронидаза человека соответствует ферменту β -галактозидазы Escherichia coli . На данном основании, а также с учетом того, что гликозидазы выполняют гидролиз, вызванный кислотными остатками, была предложена гипотеза, которая гласит о том, что остатки глутаминовой кислоты Glu540 и Glu451 являются кислотными и нуклеофильными остатками, а остаток тирозина Tyr504 участвует в катализе.

На основе анализа меченных gl-глюкуронидазой пептидов исследователи установили, что Glu540 является внутриядерным отходом, возникающим в ходе реакции нуклеофильного замещения SN2 с участием оксикарбе-ниевого иона.

Человеческая β -D-глюкуронидаза (GUSB) состоит из 651 аминокислотного остатка (приблизительно 78 кДа), куда также входит сигнальный пептид длиной 22 аминокислотных остатка и четыре N-связанных сайта гликозилирования. Четыре субъединицы образуют энзиматически-активный гомотетрамер. Структура мономера GUSB включает три структурных домена. Первый домен, который представляет собой бочкообразную структуру вместе с двумя вставками с b-шпилькой, обеспечивает механизм лизосомального нацеливания. Структура второго домена аналогична константному домену иммуноглобулина. Третий домен представляет собой мотив бочкового домена a / b или TIM и обладает активным сайтом фермента, характерным ферментам гликозилгидро-лазы. Активный сайт мономера располагается на границе раздела олигомера и, следовательно, тетрамерный комплекс содержит четыре активных центра [25].

Глюкуронирование является основным путем детоксикации в печени млекопитающих, где происходит конъюгация гидрофобных ксенобиотиков и эндобиотиков с глюкуроновой кислотой, что приводит к увеличению их растворимости. Попавший в кишечник глюкуронид подвергается воздействию бактериальной β -глю-куронидазы, которая удаляет глюкуроновую кислоту, высвобождая исходные молекулы, что приводит к увеличению активных токсинов в кишечнике и увеличению времени жизни этих веществ в кровотоке (см. рис. 2) [2; 27; 28; 39].

Следовательно, активность GUSB влияет на физиологическую активность и токсичность различных лекарств и ксенобиотиков [7]. Кроме того, бактериальная активность GUSB в слепой кишке задерживает элиминацию эндокриноразрушающего агента, бисфенола A.

Кроме отрицательного воздействия, GUSB необходим для рециркуляции важных эндогенных молекул. Например, из глицирри-зина, диглюкуронидного конъюгата глицирре- тиновой кислоты можно получить глицирре-тиновую кислоту и моноглюкуронид глицирре-тиновой кислоты, чья биологическая активность выше, чем у соответствующих глюкуронидов [1]. Также известно, что эффективность церамид-глюкуронида против рака толстой кишки была связанна с активность GUSR, так как она продуцирует биоактивные церамиды (рис. 3) [6].

В кишечной микрофлоре GUS представляет собой лизосомальную экзогликозидазу, участвующую в деградации гликозаминогликанов клеточных мембран и внеклеточного матрикса нормальных и раковых тканей слизистой толстой кишки. Ее активность обычно увеличивается при различных катаболических состояниях. При легком окислительном стрессе некоторые лизосомы разрушаются и выделяют в цитозоль гидролитические ферменты, что сопровождается апоптозом и дальнейшим выделением гидролитических ферментов из клеток [38].

Сывороточная активность GUS у человека определяется поступлением собственно- го фермента из тканей и деятельностью кишечных бактерий (Escherichia coli, Peptostreptococcus, Bacteroides и Clostridia) (рис. 3) [38]. Оценка активности лизосомальных гидролаз в сыворотке и моче может быть полезна в диагностике колоректальной аденокарциномы [3; 16; 21]. Например, у пациентов, потребляющих большое количество мяса, активность β-глюкуронидазы выше, чем у людей на вегетарианской диете [34].

Методы выделения, очистки и определение активности β -глюкуронидазы

Tamura и др. проводили оценку активности фермента со следующими модификациями: кишечные суспензии (1:100) в фосфатном буфере с рН 7 и добавляли 0,05 мл 0,12 М п-нитрофенил-в-D-глюкуронида и инкубировали при 37 °С в течение 1 часа, реакцию останавливали с помощью 0,4 М глицин-NaOH буфера (рН 10,5) и далее центрифуги-

Рис. 2. Метаболизм CPT-11 и β -глюкуронидаза E. coli

A. Внутривенно введенный CPT-11 активируется карбоксилэстеразами (CE) до SN-38. В печени СН-38 инактивируется путем глюкуронирования, и SN-38G отправляется в кишечник, где бактерии вновь удаляют глюкуронид, а свободный активный SN-38 в просвете кишечника вызывает дозозависимую диарею.

о

B. Кристаллическая структура тетрамера b-глюкуронидазы E. coli с разрешением 2,5 Α C. Четыре селективных бактериальных ингибитора b-глюкуронидазы, идентифицированных с помощью высокопроизводительного скрининга [2]

ровали при 4500 g в течение 5 минут. Абсорбцию надосадочной жидкости оценивали спектрометрически при длине волны 400 нм. Калибровочный график был построен с использованием п-нитрофенола. Анализ концентрации белка в гомогенатах, полученных путем разрушения клеток аналогичного количества кишечного содержимого, проводился с использованием метода Брэдфорда. Активность β -глюкуронидазы регистрировали в виде микромолей п-нитрофенола, высвобождаемых через 60 минут на грамм белка кишечного содержимого [4].

Для анализа активности β-глюкуронида-зы также применялись хромогенные субстраты такие как индоксил-β-D-глюкуронид (IBDG). Изменения ферментативной активно- сти проводили спектрофотометрическим методом с использованием Microplate Reader ELx 808 (Biowhittaker, Walkersville, MA, USA) при 44,5 °C и 450 нм. Показания оптической плотности снимали сразу после добавления субстрата, а именно в момент времени 0 и при увеличении времени инкубации (2, 3, 5, 7, 21 часа), чтобы оценить влияние периода инкубации на экспрессию фермента [5].

Применение β-глюкуронидазыв лечении колоректального рака

Условно-патогенные бактерии локализованные в желудочно-кишечной тракте часто возбудителями некоторых заболеваний, но фармацевтические компании разрабатывают

Рис. 3. Сравнение димерных структур GUSs у основных представителей бактерий

Примечание . Вид с верху и сбоку (a) Bifd GUS – Bifidobacterium dentium ; (b) Rg GUS – Ruminococcus gnavus ; (c) Cp GUS – Clostridium perfringens; (d) Ec GUS – Escherichia coli and (e) Bf GUS – Bacteroides fragilis . Красным цветом выделены петли, расположенные на периферии TIM-ствола (loop 3), либо в области скопления альфа-спиралей (a2-helix loop). Каждая петля альфа спирали у Bifd GUS (а) достигает участка соседней субъединицы. Петли (loop 3) у Cp GUS (c) и Ec GUS (d) простирается от своей до соседней субъединицы. И в тоже время у Rg GUS (b) не контактирует с соседней субъединицей. Димерная структура Bf GUS (e) ориентирована иначе, чем у других, поскольку активный участок двух мономеров направлен в противоположные стороны [6].

новые подходы по их использованию для лечения некоторых видов рака, что может стать «революцией» в медицинской сфере. Недавние результаты показали, что пациенты с высоким уровнем условно-патогенных кишечных бактерий более чувствительны к современной иммунотерапии вследствие чего биотехнологические компании начали конкурировать в разработке лекарств для борьбы с раком на основе использования микроорганизмов. Одним из таких примеров является PD-1, способствующий борьбе с раком, стимулируя клетки иммунной системы организма.

Бактерии, которые были модифицированы для селективной противоопухолевой активации проактивных противораковых агентов, были исследованы как перспективный подход для достижения более селективной терапии CRC [11; 19]. В данном исследовании была рассмотрена возможность усиления действия противоопухолевого препарата CPT-11 путем систематического введения Е.coli, которые были сконструированы для экспрессии β -глю-куронидазы, которая может превращать SN-38G в SN-38 и увеличивать противораковую активность от SN-38G до культивируемых раковых клеток примерно в 100 раз.

Существует два основных преимущества использования E. coli в качестве средства доставки и активации пролекарства. Во-первых, кишечная палочка способна избирательно колонизировать солидные опухоли, обеспечивая высокий коэффициент колонизации опухоли/нор-мальной ткани примерно в 10000 раз. Во-вторых, в отличие от липосом, антител или вирусов с недостаточной репликацией, бактерии могут размножаться в опухолях. Длительная колонизация опухолей может позволить многократное введение пролекарства после одной инъекции E.coli. Также было выявлены и недостатки, а именно снижение эффективности терапия с использованием b-глюкуронидазы: 1) медленное поглощение глюкуронидных соединений в E. coli может снижать скорость гидролиза пролекарства; 2) преимущественное накопление E. coli в некротических областях опухолей может препятствовать эффективному контакту систематически назначаемых препаратов с b-глюкуронидазой. Данное исследование показывает, что как клеточное, так и пространственное распределение b-глюкуронидазы и, возможно, других терапевтических ферментов может быть важным барьером для эффективной терапии рака основе использования бактерий.

Заключение

Колоректальный рак является третьим по частоте заболеваемости в мире и поэтому изучение данной темы является актуальной проблемой. Данное заболевание может развиваться из-за нарушений кишечной микрофлоры, в том числе и из-за повышения активности β -глю-куронидазы. Поэтому использование ее в качестве биомаркера для обнаружения и предотвращения развития CRC на ранних этапах является важным шагом в борьбе с этой болезнью. Помимо этого, были проведены исследования по применению бактериальной GUSB E. coli для борьбы с раком, как элемент комплексной химиотерапии, который усиливал действие противоопухолевого препарата CPT-11, переводя его в активную форму. Дальнейшее изучение β -глюкуронидазы и ее роль в развитии колоректального рака может поспособствовать снижению уровня заболеваемости и смертности по данному заболеванию.