Система регенерации салата (Lactuca sativa L.) через культуру in vitro

Vegetable crops of Russia. 2019;(3):15-17 (In Russ.)

Received: 06.06.2019

Accepted: 25.06.2019

Статья посвящена проблеме получения растений-регенерантов сортов салата (Lactuca sativa L.) Букет, Изумрудный, Хамелеон (селекции ФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства»). Культура салата является неотзывчивой к условиям in vitro и требует разработки альтернативных условий регенерации. Семена поверхностно стерилизовали в 96% этаноле (30 с), затем 15 минут в 50% водном растворе «Белизны» с добавлением Твина-20 (1 капля на 100 мл), промывали трехкратно в стерильной дистиллированной воде. Затем семена салата помещали в чашки Петри на среду Gamborg В5 (2% сахарозы, 3,0 г/л фитогеля). Через 10 суток полученные проростки черенковали, листовые пластинки иссекали на квадраты размером 1 см и переносили на среду МС В5 (2% сахарозы) с тремя вариантами концентрации гормонов: 0,1 мг/л НУК и 1 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 1 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 0,1 мг/л БАП. Образовавшиеся побеги укореняли на среде МС (2% сахарозы, 7,0 г/л агара). Культивирование проводили на стеллажах с люминесцентными лампами при 25 ° С и фотопериоде 14 часов, освещенности 2,5 тыс. люкс. По результатам исследований подобрана концентрация гормонов (0,1 мг/л НУК и 1 мг/л БАП), которая позволила получить до 10 побегов с одного листового экспланта. Наибольшее число побегов отмечалось на листовых эксплантах, расположенных ближе к центральной жилке листа. Полученные данные позволили совершенствовать системы регенерации сортов салата Изумрудный, Букет и Хамелеон.

REGENERATION SYSTEM

OF LETTUCE ( LACTUCA SATIVA L.) THROUGH IN VITRO CULTURE

The article is devoted to the problem of obtaining regenerative plant varieties of lettuce (Lactuca sativa L.) Bouquet, Emerald, Chameleon (FSBSI Federal Scientific Vegetable Center). Salad culture is insensitive to in vitro conditions and requires the development of alternative regeneration conditions. Seeds were surface sterilized in 96% ethanol (30 s), then 15 minutes in 50% aqueous solution of "Whiteness" with the addition of Twin-20 (1 drop per 100 ml), washed three times in sterile distilled water. Then lettuce seeds were placed in Petri dishes on Gamborg B5 medium (2% sucrose, 3,0 g/l fitogeli). After 10 days, the obtained seedlings were cut, the leaf blades were cut into squares 1 cm in size and transferred to medium MS B5 (2% sucrose) with three variants of hormone concentrations: 0.1 mg/l NAA and 1 mg/l BAP, 1 mg/l NAA and 1 mg/l BAP, 1 mg/l NAA and 0.1 mg/l BAP. The formed shoots were rooted on MS medium (2% sucrose, 7,0 g/l agar). Cultivation was carried out on racks with fluorescent lamps at 25 ° C and a photoperiod of 14 hours, illumination of 2,5 thousand Lux. According to the results of studies, the concentration of hormones (0,1 mg/l NAA, 1 mg/l BAP) was selected, which allowed to obtain up to 10 shoots from one leaf explant. Moreover, the largest number of shoots was noted on leaf explants located closer to the veins of the sheet. The obtained data allowed to improve the system of regeneration of varieties of emerald lettuce, Bouquet and Chameleon.

СЕЛЕКЦИЯ И СЕМЕНОВОДСТВО СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

С алат ( Lactuca sativa L.), одна из главных свежих листовых овощных культур, относится к семейству Астровые ( Asteraceae ( Compositae )). Это самоопыляемая культура, которая может возделываться круглогодично во всем мире. По данным FAOSTAT в 2017 году самыми крупными производителями являлись Китай (56%), США (14%) и страны ЕС (11%). Общий объем производства салата-латука и салата цикорного составил 26,866557 млн т (2,5% от общего объёма производства овощей). Салат является диетическим продуктом, особенно при употреблении в свежем виде. Это способствует широкому распространению культуры салата в мире и увеличению объёма производства.

Современные задачи селекции салата сводятся к улучшению качества продукции и устойчивости к вредителям и болезням. Эти задачи могут быть выполнены с использованием методов биотехнологии. С помощью культуры in vitro возможно сохранить ценные генотипы салата и получить оздоровленные семена, а также сократить период селекционных программ. Методы гаплоидизации представляют интерес для получения чистых линий. Регенерация через соматический эмбриогенез является источником сомаклональной изменчивости (Saricam et al., 2017).

Для успешного использования системы in vitro необходима надёжная система регенерации, обеспечивающая получение множественных побегов. На эффективность регенерации влияют три основных фактора: выбор отзывчивого генотипа, подбор исходного экспланта и адаптация состава питательной среды (Xinrun, Conner, 1992; Ampomah-Dwamena et al., 1997;

Mohebodini et al., 2011; Armaz et al., 2017).

В случае культуры салата многие сорта являются неотзывчивыми к условиям in vitro . Результаты регенерации сильно варьируют в экспериментах и зависят от генотипа (Curtis et al., 1994).

Органогенез побегов может быть вызван культивированием 3-7 дневных семядольных эксплантов на различных твердых средах и различной комбинацией гормонов (Doerschug, Miller, 1967; Koevary et al., 1978; Webb et al., 1984; Teng et al., 1992; Hunter, Burritt, 2002; Latif et al., 2014).

Наиболее распространенный подход (Hunter, Burritt, 2002), позволяющий получать до 72% регенерации побегов (Mohebodini et al., 2011), содержит 0,09 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК или их незначительные вариации (Teng et al., 1992; Kanamoto et al., 2003).

Замена смеси солей Мурасиге и Скуга (МС) на смесь солей Шенка и Хильдебрандта (ШХ) не влияла на результат, также замена сахарозы на глюкозу не показала отличий.

Рис. 1. Проростки салата сорта Букет через 7 и 11 суток, полученные на среде Gamborg В5 (2% сахарозы, 3,0 г/л фитогеля). Fig. 1. Sprouts of Buket variety lettuce after 7 and 11 days, obtained on Gamborg B5 medium (2% sucrose, 3.0 g / l phytogel).

Увеличение концентрации БАП с 0,09 мг/л до 9 мл/л и НУК с 0,05 мг/л до 0,45 мг/л значительно ускоряло появление побегов и скорость их роста. Однако побеги имели удлиненные стебли и листья с неправильной формой лопасти. Регенерация была очень низкой, побеги развивались медленно, часто вовсе останавливались в росте. Добавление активированного угля в питательную среду (200 мг/л) требовало повышенных концентраций гормона роста БАП (510 мг/л), хотя отмечался сильный и значительный рост побегов вокруг эксплантов у 64-87% образцов (Armaz et al., 2017).

В ФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства» в лаборатории репродуктивной биотехнологии в селекции сельскохозяйственных растений начаты исследования по клональному микроразмножению салата (Романова и др., 2019), чтобы в дальнейшем этот этап вошел в протокол получения гаплоидных растений салата через культуру in vitro .

Изумрудный

Хамелеон

Букет

Рис. 2. Культивирование эксплантов растений салата сорта Изумрудный, Хамелеон и Букет на среде МС В5 c 2% сахарозой (стрелками показано побегообразование). Fig. 2. Cultivation of plant explants lettuce varieties Emerald, Chameleon and Bouquet on medium MS B5 with 2% sucrose (the arrows indicate the shoot formation).

Рис. 3. Образование множественных проростков растений-регенерантов салата сорта Изумрудный.

Fig. 3. Formation of multiple seedlings of plants-regenerants of the Emerald variety lettuce.

Объекты и методы исследования

Целью настоящей работы является разработка системы регенерации культур вида Lactuca sativa L. Объектами исследования служили сорта салата (Lactuca sativa L.): Букет, Изумрудный, Хамелеон.

Семена листового салата поверхностно стерилизовали погружением на 30 с в 96% этанол, затем в 50% водный раствор «Белизны» с добавлением Твина-20 (1 капля на 100 мл) в течение 15 минут и промывали трехкратно в стерильной дистиллированной воде.

Поверхностно стерилизованные семена салата помещали в чашки Петри на среду Gamborg В5, содержащей 2% сахарозу и 3,0 г/л фитогеля (рис 1.). Через 14 суток полученные проростки черенковали, листовые пластинки иссекали на квадраты размером 1 см и переносили на среду МС В5 c 2% сахарозой с тремя вариантами концентрации гормонов: 0,1 мг/л НУК и 1 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 1 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 0,1 мг/л БАП. Образовавшиеся побеги укореняли на среде МС с 2% сахарозы и 7,0 г/л агара (рис. 2, 3). Культивирование проводили на стеллажах с люминесцентными лампами при 25°С и фотопериоде 14 часов, освещенности 2,5 тыс. люкс.

Результаты

Согласно проведенным исследованиям для регенерации сортов салата

Изумрудный, Букет и Хамелеон были определены оптимальные питательные среды для индукции (Gamborg В5 c 2% сахарозой и 3,0 г/л фитогеля), регенерации (МС В5 c 2% сахарозой) и укоренения побегов салата (МС с 2% сахарозой и 3,0 г/л фитогеля). Также была подобрана концентрация гормонов (0,1 мг/л НУК и 1 мг/л БАП), которая позволила получить до 10 побегов с одного листового экспланта. Причем наибольшее число побегов отмечалось на листовых эксплантах, расположенных ближе к центральной жилке листа. Регенерация для сорта Букет характеризовалась длительной стадией калусообразова-ния (рис. 2). Полученные данные позволили совершенствовать технологию регенерации сортов салата Изумрудный, Букет и Хамелеон.

Регенерация салата in vitro может занять месяцы из-за неудачного сочетания генотипа и состава питательной среды (Teng et al., 1992; Xinrun, Conner, 1992; Curtis et al., 1994; Ampomah-Dwamena et al., 1997). Невозможно найти состав среды, которая обеспечивает высокие уровни индукции на любом сорте салата. Для неотзывчивых сортов необходима разработка альтернативных условий регенерации.

Об авторах: