Системное воспаление и иммунологическое микроокружение в прогнозе течения солидных опухолей

Актуальность вопроса

Злокачественная опухоль является крайне динамической системой, которую целесообразно рассматривать в комплексе со всеми клиническими и морфологическими составляющими, и формирующими ее микроокружение (клетки стромы, клетки системы иммунитета, кровеносные, лимфатические сосуды и экстрацеллюлярный матрикс), и определяющими общую реакцию организма пациента на развивающийся опухолевый процесс [2, 7].

Иммунная система и клетки, инфильтрирующие опухоль, являются объектом активного изучения [1, 4, 12], поскольку им отводится ключевая роль в формировании противоопухолевого иммунитета. Многообразие субпопуляций иммунных клеток, а также основных продуктов их синтеза и путей совместного взаимодействия может объяснять их возможное диаметрально противоположное действие: от активации путей противоопухолевой защиты до потенциирования прогрессирования заболевания.

Кроме того, в литературе встречаются данные, свидетельствующие о том, что хроническое воспаление является риском развития опухоли и ее прогрессирования [3].

Материалы и методы

Основные критерии включения пациентов в исследование:

Основные критерии исключения пациентов из исследования:

• 1.    Наличие в анамнезе воспалительных заболеваний (в том числе признаков воспаления в опухоли и окружающих пространствах).

• 2.    Поддерживающая антибактериальная и иммуномодулирующая терапия на момент включения в исследование.

Всем пациентам с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта проводилось лечение согласно существующим стандартам (I–II стадия — хирургическое лечение; III–IVA стадия — индукционная химиотерапия; IVB стадия — лекарственная терапия 1 линии).

На этапе исходной оценки всем пациентам был проведен стандартный комплекс обследований: физикальный осмотр, клинический и биохимический анализ крови (анализатор «Abbott Diagnostic», США: Cell-Dyn 3700 SL и Architect c8800), электрокардиограмма в 12-ти отведениях, компьютерная томография с целью уточнения распространенности опухолевого процесса. Все пациенты имели удовлетворительный общий статус, определенный по шкале ECOG — 1 балл.

Методика расчета клинических факторов воспаления

С целью выявления прогностической ценности клинических маркеров воспаления нами был произведен расчет следующих соотношений (по результатам клинического анализа крови на этапе исходной оценки):

• 1)    нейтрофильно-лимфоцитарный индекс (НЛИ), который рассчитывался как отношение абсолютного числа нейтрофилов к абсолютному числу лимфоцитов в периферической крови,

• 2)    тромбоцитарно-лимфоцитарный индекс (ТЛИ), который рассчитывался как отношение абсолютного числа тромбоцитов к абсолютному числу лимфоцитов в периферической крови, 3) моноцитарно-лимфоцитарный индекс (только для группы пациентов с опухолями слизистой оболочки полости рта), который рассчитывался как отношение абсолютного числа

моноцитов к абсолютному числу лимфоцитов в периферической крови.

Методика определения нейтрофильной и эозинофильной инфильтрации опухоли и ее микроокружения, и иммуногистохимического исследования с целью выявления инфильтрации опухоли CD8 Т-лимфоцитами.

Выполнение иммуногистохимического исследования проводилось по стандартному протоколу: срезы с парафиновых блоков наносились на поли-L-лизиновые стекла с последующей инкубацией их при температуре 35-37°С в условиях термостата для их плотного прикрепления. Затем выполнялась депарафинизация материала в ксилоле, отмывание в 96% и 70% этиловых спиртах и дистиллированной воде. После этого проводилась демаскировка антигенов при температуре 96оС в буфере AntigenRetrievalSolution (DAKO), pH-9,0. Впоследствии выполнялись ингибирование эндогенной пероксидазы 3% перекисью водорода и инкубация первых антител (CD8 — DAKO, клон C8/144B, 1:100; p16ink4a — NeoMarkers, клон 16P04, 1:600); выявление процесса связывания антиген-антитело осуществлялось при помощи системы визуализации DakoEnVision и диаминобензидина в качестве хромогена. Окрашивание ядер осуществлялось при помощи гематоксилина Майера.

Оценка результатов исследования осуществлялась с помощью светового микроскопа ОlympusCX41, камера DP72. Подсчет количества нейтрофилов и эозинофилов осуществлялся на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, CD8-позитивных Т-лимфоцитов — на препаратах, окрашенных иммуногистохимическим способом. Количество клеток подсчитывалось на 1 мм2 (5 полей зрения при увеличении Х400, окуляре WHB10X/20) двумя способами: только в опухолевой ткани и в опухолевой ткани и прилежащей строме, однако опухоль должна была занимать не менее 50% поля зрения. Оценка иммуногистохимического исследования p16ink4a осуществлялась путем подсчета позитивных клеток относительно 2000 злокачественных клеток, и в случае ограниченности материала процент позитивных клеток высчитывался относительно всех опухолевых клеток на срезе.

Основные оцениваемые параметры

Основными конечными точками в данном исследовании были общая выживаемость и безрецидивная выживаемость.

Безрецидивная выживаемость определялась как время от момента наступления ремиссии заболевания на фоне проводимого лечения до времени регистрации рецидива.

Анализ выживаемости проводился с использованием процедуры Каплана-Майера, а сравнение кривых выживаемости — с использованием log-rank теста. Медиана общей выживаемости рассчитывалась с двусторонним 95% доверительным интервалом (ДИ).

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с помощью программ статистических пакетов STATISTICA, ver. 12.0, MedCalc, ver. 18.11.6, PASS 11, ver. 11.0.7, Microsoft Excel 2010.

Результаты исследования

Группа пациентов с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

Под нашим наблюдением находились 60 пациентов, 37 мужчин и 23 женщины, в возрасте от 42 до 82 лет, медиана возраста составила 59 лет (95% ДИ от 57 до 65 лет). Все пациенты проходили лечение в СПб ГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер» по поводу верифицированного плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта с 2010 года по 2015 год.

У 26 (43,33 %) больных первичный опухолевый очаг локализовался на слизистой оболочке передней и средней третей языка, у 13 (21,67%) — на слизистой оболочке дна полости рта, у 4 пациента (6,67%) отмечено поражение задней трети или корня языка и альвеолярной части нижней челюсти; слизистая оболочка щеки явилась первичным очагом у 3 (5,00%) пациентов, у 2 пациентов 3,33%) обнаружена опухоль слизистой оболочки ретромолярной области. По 1 пациенту (1,66%) имели первичные поражения слизистой оболочки альвеолярного отростка верхней челюсти, прежней небной дужки, боковой стенки глотки, твёрдого неба, слизистой оболочки крыло-челюстной складки и слизистой верхнечелюстной пазухи.

После проведённого стандартного обследования была определена стадии заболевания, при этом ни одного случая диссеминированного процесса не зарегистрировано. I стадия заболевания установлена у 3 (5,0%) пациентов, II — у 7 (11,8%), III стадия — у 8 (13,2 %) и IV — у 42 (70,0 %) больных (IVA — 37, IVB — 5 пациентов).

Согласно проведённому морфологическому исследованию, 23 (38,33%) пациентов имели высокодифференцированные опухоли, 15 (25,00%) — умереннодифференцированные, и 5 (8,33%) — низ- кодифференцированные; у 17 (28,33%) больных степень дифференцировки опухоли не определена. В 27 (45,0%) образцах из 60 выявлены признаки ороговения, в 16 (26,7%) они отсутствовали, в 2 (3,3%) образцах имелись признаки частичного ороговения, а в остальных 15 (25,0%) ороговение не определено.

Исследование иммунологического микроокружения опухоли

При ИГХ-исследовании у пациентов данной группы получены следующие результаты.

Показатель нейтрофильного звена микроокружения варьировал в пределах от 0 до 112 клеток в кв.мм. (8 стандартных полей зрения): средний показатель составил 50,00 ± 32,88.

Эозинофильный компонент варьировал в пределах от 0 до 10 клеток в мм2. Среднее количество эозинофилов составило 6,67 ± 3,33 клеток.

Частота CD8-положительных клеток колебалась в пределах от 26 до 380 клеток/мм2, средний показатель составил 198,67 ± 102,28.

Группа пациентов с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

Показатель нейтрофильного звена в опухоли и в непосредственном микроокружении варьировал в пределах от 5 до 1050 клеток в мм2 (8 стандартных полей зрения); средний показатель в опухоли составил 101,33 ± 21,77, в микроокружении — 175,72 ± 29,01.

Эозинофильный компонент в опухоли и в непосредственном микроокружении варьировал в пределах от 0 до 872 клеток в мм2 (8 стандартных полей зрения), причем столь высокий уровень эозинофильной инфильтрации был выявлен только у одного пациента из 60; средний показатель в опухоли составил 16,19 ± 10,72, в микроокружении — 37,29 ± 17,79.

Экспрессия CD8 колебалась в пределах от 3 до 1380 кле-ток/мм2; средний показатель в опухоли составил 144,14 ± 21,87, в микроокружении — 451,02 ± 42,90.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Исследование факторов воспаления

Уровень нейтрофилов периферической крови пациентов варьировал в пределах от 1,63 до 13,80 × 109/л, средний показатель составил 5,43 ± 0,52 × 109/л.

Таблица 1. Результаты анализа иммунологического микроокружения опухоли

Уровень тромбоцитов периферической крови пациентов варьировал в пределах от 163,00 до 737,00 × 109/л, средний показатель составил 346,56 ± 23,58 × 109/л.

Уровень лимфоцитов периферической крови пациентов варьировал в пределах от 0,81 до 3,32 × 109/л, средний показатель составил 1,88 ± 0,12 × 109/л.

Расчет относительных индексов продемонстрировал следующие результаты.

Нейтрофильно-лимфоцитарный индекс варьировал в пределах от 0,82 до 15,06, средний его показатель составил 3,42 ± 0,49 × 109/л.

Тромбоцитарно-лимфоцитарный индекс варьировал в пределах от 72,00 до 535,30, средний его показатель составил 208,59 ± 20,44.

Группа пациентов с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

Уровень нейтрофилов периферической крови пациентов варьировал в пределах от 1,75 до 10,51 × 109/л, средний показатель составил 4,53 ± 0,26 × 109/л.×

Уровень тромбоцитов периферической крови пациентов варьировал в пределах от 144,00 до 653,00 × 109/л, средний показатель составил 305,35 ± 14.02 × 109/л.

Уровень моноцитов периферической крови пациентов варьировал в пределах от 0,05 до 1,05 × 109/л, средний показатель составил 0,52 ± 0,03 × 109/л.

Уровень лимфоцитов периферической крови пациентов варьировал в пределах от 0,84 до 3,83 × 109/л, средний показатель составил 2,15 ± 0,09 × 109/л.

Расчет относительных индексов показал следующие результаты.

Нейтрофильно-лимфоцитарный индекс варьировал в пределах от 0,65 до 7,22, средний его показатель составил 2,34 ± 0,18.

Тромбоцитарно-лимфоцитарный индекс варьировал в пределах от 55,03 до 428,10, средний его показатель составил 155,70 ± 10,12.

Попытка выявить корреляционные зависимости между иммунологическим опухолевым окружением (инфильтрация опухоли и микроокружения нейтрофилами, эозинофилам, экспрессия CD8 Т-лимфоцитами) и показателями периферической крови не удалась, что свидетельствует о том, что эти факторы могут являются самостоятельными и независимыми прогностическими маркерами.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Оценка выживаемости

С целью оценки влияния факторов воспаления на выживаемость нами была произведена оценка влияния рассматриваемых параметров на общую и безрецидивную выживаемость пациентов обеих групп.

Достоверной зависимости общей выживаемости от инфильтрации опухоли и ее микроокружения нейтрофилами, эозинофилами и CD8 Т-лимфоцитами в данной когорте пациентов выявлено не было (р>0,05).

Проведен многофакторный анализ с построением модели Кокса. Помимо исследуемых факторов в данную модель были включены демографические характеристики пациентов (пол, возраст), а также такие характеристики опухолевого процесса, как локализация первичной опухоли, стадия процесса и дифференцировка опухоли.

Вероятность влияния экспрессии CD8 на общую выживаемость составила 0,57 (95% CIofExp (b) от 0,96 до 1,03), вероятность влияния нейтрофильного компонента — 0,87 (95% CIofExp (b) от 0,98 до 1,01), а эозинофильного — 0,25 (95% CIofExp (b) от 0,95 до 1,13). Общий уровень значимости модели Кокса составил p=0,65.

Столь низкая значимость исследуемых показателей связана, по всей видимости, с малым объемом выборки, что говорит о необходимости дальнейшего исследования.

С целью оценки прогностической ценности нейтрофильнолимфоцитарного и тромбоцитарно-лимфоцитарного индексов на общую выживаемость нами были использованы средние значения данных индексов как минимальные пороговые значения (2,43 для НЛИ и 166,91 для ТЛИ); максимальным пороговым значением для НЛИ было выбрано максимальное значение 95% порогового интервала (4,04 для НЛИ).

Общая выживаемость пациентов у пациентов с низким показателем нейтрофильно-лимфоцитарного индекса (<2,43) составила 16 месяцев (95% ДИ от 12 до 23 месяцев), что достоверно (р=0,0382) отличается от выживаемости пациентов в группе умеренного (2,43–4,04) показателя НЛИ, где она составила 8 месяцев (95%ДИ от 5 до 26 месяцев), и группы высокого НЛИ (> 4,04), где она составила 7 месяцев (95%ДИ от 4 до 16 месяцев) (рис. 1).

Таблица 2. Результаты анализа клинических маркеров воспаления

Группа пациентов с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

Нами была оценена общая и безрецидивная выживаемость пациентов с использованием модели Kaplan-Meier: медиана общей выживаемости составила 8 месяцев (95% CI от 7,000 до 12,000); медиана времени до прогрессирования составила 6 месяцев (95% CI от 4,000 до 9,000).

Нами был проведен многофакторный анализ влияния количественных показателей наличия нейтрофилов, эозинофилов и экспрессии CD8 на общую и безрецидивную выживаемость с использованием модели Кокса. Помимо исследуемых факторов в данную модель также были включены демографические характеристики пациентов (пол, возраст), а также такие характеристики опухолевого процесса, как локализация первичной опухоли, стадия процесса, дифференцировка опухоли и степень ороговения.

Достоверных влияний пока не было выявлено, что, вероятнее всего, связано с малым объемом выборки, однако о тенденции к влиянию на общую выживаемость говорить можно, это подтверждает прогностическую ценность этих показателей.

Рисунок 3. Выживаемость без прогрессирования больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от уровня нейтрофильно-лимфоцитарного соотношения.

Вероятность влияния экспрессии CD8 на общую выживаемость составила p=0,08 (95% CIofExp (b) от 0,84 до 1,01), вероятность влияния нейтрофильного компонента — 0,07 (95% CIofExp (b) от 0,91 до 1,01), а эозинофильного — 0,12 (95% CIofExp (b) от 0,98 до 1,00). Общий уровень значимости модели Кокса — p=0,08.

Вероятность влияния на время до прогрессирования оказалась малозначительна: значимость экспрессии CD8 составила p=0,29 (95% CIofExp (b) от 0,96 до 1,00), вероятность влияния нейтрофильного компонента — p=0,72 (95% CIofExp (b) от 0,98 до 1,01), а эозинофильного — p=0,08 (95% CIofExp (b) от 0,84 до 1,06). Общий уровень значимости модели Кокса составил p=0,17.

Для оценки прогностической ценности НЛИ, МЛИ и ТЛИ на общую выживаемость мы использовали пороговые значения данных индексов: как минимальные значения были выбраны 2,33 для НЛИ, 5,28 для МЛИ и 155,70 для ТЛИ); максимальным пороговым значением для НЛИ было выбрано значение 5,0.

Медиана общей выживаемости пациентов с низким показателем нейтрофильно-лимфоцитарного индекса (< 2,43) составила 55 месяцев (95% ДИ от 41 до 58 месяцев), что отличается (р=0,08) от выживаемости пациентов в группе умеренного (2,43–5,0) и высокого (> 5,0) показателя НЛИ, где она достигнута не была, но среднее значение составило 21,8 ± 3,76 (95% ДИ от 14,44 до 29,16), а также от группы высокого уровня НЛИ, где медиана общей выживаемости также еще не достигнута, среднее значение составило 17,72 ± 1,21 (95% ДИ от 15,35 до 20,11).

Медиана времени до прогрессирования пациентов у пациентов с умеренным показателем нейтрофильно-лимфоцитарного индекса (2,43–5,0) составила 12 месяцев (95% ДИ от 7 до 15 месяцев), что отличается (р=0,07) от выживаемости пациентов в группе низкого (< 2,43) и высокого (> 5,0) показателя НЛИ, где она составила 8 месяцев (95%ДИ от 4 до 9 месяцев) и 6 месяцев (95%ДИ от 5 до 9 месяцев), соответственно (рис. 3).

Влияние тромбоцитарно-лимфоцитарного индекса (ТЛИ) на общую выживаемость и время до прогрессирования также демонстрирует связь рассматриваемых показателей с выживаемостью больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта. Медиана общей выживаемости была достигнута только в группе с низким уровнем ТЛИ (<155,70) и составила 55 месяцев, а в группе высокого ТЛИ в среднем общая выживаемость составляет на сегодняшний момент 6 месяцев. Подобные разли- чия, вероятно, связаны с малочисленностью группы пациентов, имеющих исходно низкий уровень ТЛИ.

Медиана времени до прогрессирования у пациентов с низким уровнем соотношения абсолютного числа тромбоцитов к абсолютному числу нейтрофилов (<155,70) составила 7 месяцев (95% ДИ от 5 до 9 месяцев), достоверно отличаясь от таковой у больных с высоким показателем ТЛИ — 2 месяца (95% ДИ от 2 до 5 месяцев) (р=0,0499), что может свидетельствовать о прогностической значимости данного показателя для выявления ранних признаков рецидивирования процесса (рис. 4).

Показатель моноцитарно-лимфоцитарного индекса не показал значимого влияния на показатели общей и безрецидивной выживаемости.

Обсуждение

Кроме того, проведенный нами анализ позволил предположить прогностическую ценность количественного определения элементов иммунологического микроокружения опухолей (особенно плоскоклеточного рака головы и шеи), поскольку показал значимое влияние экспрессии CD8 Т-лимфоцитов, нейтрофилов и эозинофилов на клиническое течение заболевания и степень ответа на проводимую терапию.

Нейтрофильно-лимфоцитарное соотношение может быть достоверным прогностическим маркером выявления раннего рецидива плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта. Мета-анализ 25 исследований с включением 6847 больных плоскоклеточным раком органов головы и шеи, проведенный L. Yang с соавторами, показал высоко достоверную негативную прогностическую значимость нейтрофильно-лимфоцитарного индекса на общую и безрецидивную выживаемость у пациентов данной когорты, тогда как тромбоцитарно-лимфоцитарный индекс подобной значимостью не обладает [14]. В своей работе W. Yu с соавторами также говорит о том, что высокий показатель нейтрофильно-лимфоцитарного индекса может служить независимым неблагоприятным фактором, ассоциированным с более высоким риском рецидива заболевания у пациентов с опухолями головы и шеи; однако, в этой работе достоверной ассоциации риска рецидивирования и влияния тромбоцитарно-лимфоцитарного индекса на общую выживаемость выявлено не было [15]. Данный факт подтвержден и нашим исследованием.

Рисунок 4. Выживаемость без прогрессирования пациентов с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от уровня тромбоцитарно-лимфоцитарного соотношения.

Заключение