Содержание дофамина и норадреналина в коре головного мозга мышей BALB/C NUDE с первично-множественными злокачественными новообразованиями

Введение. Первично-множественные злокачественные опухоли (ПМЗО) характеризуются наличием двух или более первичных неоплазм у одного пациента [1]. Частота их встречаемости варьирует в разных странах от 0,52 % до 11,7 % всех злокачественных новообразований [2, 3]. Однако в последние десятилетия во всем мире наблюдается увеличение количества больных с ПМЗО [3–5]. В России абсолютное число случаев возникновения ПМЗО за 1991–2000 гг. выросло в 2,9 раза – с 1,9 до 5,5 на 100 тыс. населения [6], к 2014 г. – до 24,8 на 100 тыс. [7], а в 2020 г. достигло 36,0 на 100 тыс. населения, что составляет 9,5 % всех впервые выявленных злокачественных новообразований [8].

Длительная стрессовая нагрузка, особенно при наличии первичного иммунодефицита (ПИД), активирует симпатическую и ги-поталамо-гипофизарно-надпочечниковую системы, что приводит к высвобождению гормонов стресса, прежде всего глюкокортикоидов и катехоламинов. Взаимодействие между гормонами и их рецепторами может оказы- вать ряд физиологических эффектов на опухолевые и стромальные клетки [9]. Влияние хронического стресса на заболеваемость и прогрессирование многих видов рака показано в исследованиях как на людях, так и на животных [10, 11]. При этом несколькими крупными когортными исследованиями продемонстрирован повышенный относительный риск развития рака у пациентов с ПИД [12, 13].

Возникающие в лечении сложности [14] наряду с прогрессирующим ростом заболеваемости диктуют необходимость изучения патогенеза ПМЗО с целью разработки эффективных критериев диагностики и усовершенствования тактики лечения. Важную роль в понимании патогенетических основ канцерогенеза играют экспериментальные модели. Для создания модели ПМЗО нами использованы штаммы меланомы В16/F10 и карциномы легкого Льюиса (LLC), которые одномоментно перевивались мышам BALB/c Nude. Сочетанная перевивка самкам меланомы B16/F10 справа и LLC слева увеличивала злокачественный потенциал меланомы и уменьшала злокачественный потенциал LLC, что выражалось в увеличении объема первой и уменьшении объема второй, при этом продолжительность жизни животных уменьшалась по сравнению с самостоятельной перевивкой каждой опухоли (патент № 2759487) [15]. У самцов в модели ПМЗО наблюдался рост обеих опухолей – меланомы B16/F10 и LLC, что также сопровождалось уменьшением продолжительности жизни животных. При изолированной перевивке подкожный узел LLC не формировался вовсе, тогда как объем меланомы был статистически значимо больше, чем в модели ПМЗО [16]. Ранее установлено, что на развитие меланомы B16/F10 у мышей оказывают влияние различные коморбидные патологии, в т.ч. наличие хронической нейропатической боли [17], при этом более агрессивному течению злокачественного процесса под влиянием боли у самок мышей способствует ограничение включения стресслимитирующих механизмов в головном мозге [18].

Как известно, дофамин, норадреналин, адреналин и серотонин, играют важную роль в различных неврологических функциях, поскольку, являясь нейротрансмиттерами, изменяют синаптическую активность и, следовательно, функционирование нейронов [19]. Дофамин участвует в движении, обучении и мотивации, генерируя тормозящие постсинаптические потенциалы. Нейроны, синтезирующие норадреналин, имеют свои клеточные тела в области ствола головного мозга и посылают проекции в другие области головного мозга, гипоталамус и спинной мозг. Изменение уровня биогенных аминов в головном мозге коррелирует с церебральными дисфункциями и состоянием животных в целом [20, 21].

В обзоре C. Sarkar et al. освещена регуляторная роль катехоламиновых нейротрансмиттеров в регуляции опухолевого ангиогенеза и опухолевого иммунитета, имеющих большое значение в процессе канцерогенеза. Показано, что дофамин ингибирует опухолевый ангиогенез и стимулирует опухолевый иммунитет, тогда как норадреналин и адреналин стимулируют ангиогенез и ингибируют иммунные функции при раке [22].

Высокая концентрация катехоламинов в зоне роста злокачественных опухолей на ранних стадиях канцерогенеза способствует выживанию и пролиферации неопластических клеток в условиях гипоксии [23]. Установлено также, что уровень дофамина в коже коррелирует с частотой возникновения в ней меланоцитарных и немеланоцитарных опухолей [24].

Согласно данным последних лет раковые клетки используют сигнальный путь, инициируемый нейротрансмиттерами, для активации неконтролируемой пролиферации и диссеми-нации. Показано также, что нейротрансмиттеры могут воздействовать на иммунные и эндотелиальные клетки в микроокружении опухоли, способствуя ее прогрессированию [25]. В этой связи, исходя из значимости катехола-минергических медиаторных систем в процессах опухолевого развития, рассматриваются перспективы разработки стратегий лечения рака, основанных на использовании катехоламинов и/или их агонистов/антагонистов в качестве новых противоопухолевых препаратов [22, 25].

Цель исследования. Сравнительный анализ содержания дофамина и норадреналина в коре головного мозга иммунодефицитных мышей разного пола при изолированном и сочетанном росте (модель ПМЗО) экспериментальных опухолей.

Материалы и методы. Исследование проведено на полученных из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (филиал «Андреевка», Московская область) 56 мышах обоего пола линии BALB/c Nude, 8–9-недельного возраста, массой тела 21–22 г. Мыши содержались в одинаковых условиях при естественном режиме освещения, температуре воздуха 22–26 °С, относительной влажности воздуха 40–75 % со свободным доступом к воде и пище (режим кормления и поения ad libitum). Работа проводилась в соответствии с Директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей. Все манипуляции производились в боксе с соблюдением общепринятых правил асептики. Протокол экспериментального исследования одобрен Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России от 01.09.2020 (протокол № 21/99).

Штаммы опухолевых клеток (мышиной меланомы В16/F10 и карциномы легких Льюиса) были получены из ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Мыши были разделены на 7 групп (по 8 мышей в каждой): 4 группы самок (интактные, с изолированной перевивкой меланомы В16/F10 (подкожно ниже правой лопатки 0,5 мл взвеси меланомы В16/F10) или LLC (подкожно ниже левой лопатки 0,5 мл взвеси LLC), с моделью ПМЗО (перевивка меланомы В16/F10 справа и LLC слева на одну мышь в тех же дозах) и 3 группы самцов (те же группы, что и для самок, за исключением LLC в самостоятельном варианте, которая у самцов не воспроизводилась). Взвесь клеток В16/F10 или LLC готовилась на физиологическом растворе в разведении 1:20, в 0,5 мл взвеси содержалось 0,5 млн клеток.

Мыши декапитировались на гильотине на 22-е сут после перевивки опухолей, по- скольку с этих суток начиналась гибель животных с ПМЗО, продолжительность жизни которых была минимальной по сравнению с изолированным ростом опухолей. Для исследования забиралась кора головного мозга и на льду готовились 1 % цитозольные фракции на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА. В цитозольной фракции гомогенатов методом ИФА определялось содержание дофамина (ДА) и норадреналина (НА) (IBL International, Германия).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере посредством программы STA-TISTICA 10.0 при помощи параметрического критерия Стьюдента, поскольку данные всех групп соответствовали закону о нормальном распределении. Результаты представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения среднего (M±σ), указаны также медиана и значения нижнего и верхнего квартилей (Me [Q25; Q75]). Сравнение данных опытных групп с показателями интактных животных производилось попарно. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение. У самок с ПМЗО динамика роста опухолей имела особенности. Так, на 15-е сут объем меланомы В16/F10 в модели ПМЗО был в 2,8 раза больше, а объем LLC, напротив, в 2,2 раза меньше, чем при изолированном росте каждой из опухолей. На 22-е сут объем меланомы В16/F10 в модели ПМЗО был в 1,8 раза больше, а объем LLC в 2,3 раза меньше, чем при самостоятельной перевивке. У самцов в модели ПМЗО на 15-е сутки В16/F10 и LLC имели сравнимые объемы, при этом объем подкожного узла меланомы В16/F10 был в 7,2 раза меньше, чем при самостоятельном варианте роста. На 22-е сут объем меланомы В16/F10 в модели ПМЗО хотя и увеличился в 6,6 раза по сравнению с предыдущим периодом, но оставался в 2,6 раза меньше, чем при самостоятельном варианте роста, а объем LLC увеличился относительно объема соответствующей опухоли на 15-е сут в 3,1 раза.

Уровни ДА и НА в коре головного мозга мышей BALB/c Nude оказались сниженными практически при всех вариантах роста опу- холей вне зависимости от пола животных (табл. 1).

У интактных мышей линии BALB/c Nude выявлены существенные различия в соотношении катехоламинов, зависящие от пола животных: у самок уровень ДА превышал уровень НА почти в 7 раз, в то время как у самцов различий в содержании этих моноаминов не наблюдалось. При этом у самок выше был уровень ДА (в 3,7 раза), а у самцов – уровень НА (в 1,8 раза) по сравнению с соответствующими показателями животных другого пола (табл. 1).

Таблица 1

Table 1

Содержание биогенных аминов в коре головного мозга мышей BALB/c Nude с моделью ПМЗО

Biogenic amine content in BALB/c Nude mice cerebral cortex, MPMT model

Группы животных Animal groups	ДА, нг/г ткани DA, ng/g in tissue samples	НА, нг/г ткани NE, ng/g in tissue samples	Индекс НА/ДА NE/DA index
Самки / Females
Интактные Intact animals	150,6±7,8 148,4 [144,7; 156,5]	22,1±2,75 21,2 [20,0; 24,2]	0,146±0,011 144,7 [0,138; 0,155]
Меланома В16/F10 B16/F10 melanoma	64,4±2,51 63,6 [61,9; 65,9] р=0,0000	23,5±1,82 23,9 [21,4; 25,5] р>0,05	0,365±0,006 0,371 [0,363; 0,382] р=0,0000
Карцинома Льюиса Lewis lung carcinoma	51,5±3,81 50,25 [48,6; 54,4] р=0,0000	16,3±1,07 16,4 [15,55; 17,05] р=0,0001	0,317±0,015 0,3115 [0,307; 0,327] р=0,0000
Меланома В16/F10 + карцинома Льюиса B16/F10 melanoma + Lewis lung carcinoma	45,2±1,83 44,85 [43,85; 46,55] р=0,0000	15,9±1,14 16,15 [15,05; 16,75] р=0,00004	0,352±0,015 0,355 [0,3405; 0,3625] р=0,0000
Самцы / Males
Интактные Intact animals	40,2±2,43 39,7 [38,4; 42,0]	40,5±2,16 40,05 [38,9; 42,1]	1,008±0,022 1,0075 [0,998; 1,013]
Меланома В16/F10 B16/F10 melanoma	39,3±1,1 38,8 [37,5; 40,1] р>0,05	18,9±1,66 18,45 [17,65; 20,15] р=0,0000	0,481±0,007 0,477 [0,461; 0,489] р=0,0000
Меланома В16/F10 + карцинома Льюиса B16/F10 melanoma + Lewis lung carcinoma	25,1±1,79 25,25 [23,85; 26,35] р=0,0000	23,1±1,67 22,7 [21,85; 24,35] р=0,0000	0,921±0,028 0,9305 [0,899; 0,9425] р=0,00001

Примечание. р – статистическая значимость различий по отношению к показателю интактных животных соответствующего пола.

Note. p – the differences are significant compared with the intact animals of the same sex.

При всех вариантах опухолевого роста у самок наблюдалось снижение содержания ДА в 2,3–3,3 раза по сравнению с интактными самками, однако превалирование ДА над НА сохранялось на уровне 2,7–3,2 раза. При самостоятельном росте меланомы В16/F10 или LLC снижение содержания ДА в коре мозга у самок составило соответственно 57,2 % и 65,8 %, а при ПМЗО достигло 70 %. У самцов статистически значимо ДА снизился только при сочетанном росте обеих опухолей – на 37,6 % (р=0,000000 во всех случаях). Содержание НА у самок было снижено при LLC и ПМЗО на 26,2 % и 28,1 % (р<0,0001), а у самцов снижение уровня НА достигло 53,3 % и 43 % (р=0,000000) соответственно при меланоме В16/F10 и ПМЗО.

Суммарную концентрацию НА и адреналина (А) в крови или тканях относят к стрес-среализующим компонентам, а ДА и серотонин (С) рассматривают в качестве стрессли-митирующих компонентов [26], что позволило предложить стрессорный индекс: (А+НА)/(ДА+С), характеризующий уровень стрессогенности отдельных тканей, который успешно используется в экспериментальной онкологии [27]. Поскольку из всех моноаминов в нашей работе определялось содержание в ткани мозга только НА и ДА, мы рассчитали соотношение уровней этих катехоламинов (НА/ДА), которое также помогает оценить уровень стресса. Как оказалось, у самок при всех вариантах развития опухоли отмечалось увеличение индекса НА/ДА в 2,2–2,5 раза (р=0,000000), в то время как у самцов наблюдалось снижение данного показателя: при меланоме В16/F10 в 2,1 раза, а при ПМЗО лишь на 8,6 %, хотя и статистически значимо (р<0,00001).

Полученные нами данные о существенно меньшем снижении стрессреализующего нейромедиатора НА на фоне более выраженного снижения уровня стресслимитирующего ДА при опухолевом росте у самок по сравнению с самцами являются подтверждением стрессоустойчивости самцов. О большей подверженности стрессу именно самок свидетельствует наблюдаемое только у них более чем двукратное повышение индекса НА/ДА в коре головного мозга.

Согласно данным литературы медиальная префронтальная кора головного мозга, играющая решающую роль в регулировании реакции на стресс, получает ДА-эргические афференты, исходящие из вентральной тегментальной области, и этот путь имеет решающее значение в нервных цепях, которые участвуют в регуляции процессов в мозге [28]. Кроме того, ДА является важной частью адаптивного ответа на хронический стресс и участвует в регуляции прогрессирования опухоли и пролиферации раковых клеток [29–31]. X.R. Xu et al. показали, что хронический стресс способствует прогрессированию рака молочной железы у мышей BALB/c Nude. Авторы продемонстрировали, что повторная стимуляция нервных окончаний в префронтальной коре значительно ослабляет прогрессирование опухоли, вызванное хроническим стрессом [32].

Параллельно с исследованием содержания ДА и НА в тех же группах мышей BALB/c Nude нами был изучен уровень нейротрофи-нов [33], которые, согласно данным литературы, функционально связаны с катехола-минэргическими системами. Так, нейротро-фин-3 (NT-3) может способствовать внутриклеточному пути дифференцировки ДА-ерги-ческих нейронов [34], а фактор роста нервов (NGF) регулирует экспрессию генов нескольких функционально важных соединений, включая нейротрансмиттеры, рецепторы и белки, участвующие в передаче боли [35]. Было установлено, что уровень NGF снижается у животных обоего пола при всех вариантах опухолевого роста в 1,5–3 раза, а уровень NT-3 при ПМЗО повышается у самок лишь в 1,3 раза, а у самцов не изменяется [33]. Таким образом, в большинстве случаев выявленные половые различия касались содержания катехоламинов, а изменения уровня нейротро-финов были в основном однонаправленными у самок и самцов.

Сопоставление динамики концентрации изученных нейромедиаторов и нейротрофи-нов показало, что при самостоятельном росте меланомы В16/F10 в коре головного мозга мышей различия касались изменения уровня именно нейротрансмиттеров: у самок снижался ДА в 2,3 раза, а у самцов НА в 2,1 раза. Более выраженные половые различия отмечены при ПМЗО. В коре головного мозга самок максимально (в 3,3 раза) снизился уровень ДА при снижении содержания НА лишь в 1,4 раза и NGF в 2,6 раза, что позволяет думать о торможении стресслимитирующих процессов. У самцов наблюдалось сбалансированное снижение ДА (в 1,6 раза) и НА (в 1,8 раза) при значительном (в 2,6–3 раза) снижении уровня нейротрофинов BDNF и NGF, тогда как в мозге самок содержание BDNF и NT-3, напротив, было повышено (в 1,4 и 1,3 раза).

Важно, что размеры обеих опухолей в модели ПМЗО у самок, являющихся более подверженными стрессу, были в разы больше, чем у самцов: через три недели после перевивки опухолей различия в меланоме В16/F10 достигли 3,4 раза, в LLC – 1,7 раза [33]. Таким образом, полученные нами результаты указывают на наиболее активное участие нейромедиаторов коры головного мозга в реализации программ опухолевого роста у животных обоего пола, сопряженного, вероятно, с проявлениями хронического стресса.

Заключение. Сравнительный анализ содержания катехоламинов в коре головного мозга интактных самок и самцов мышей линии BALB/c Nude выявил значимые отличия: у самок был выше уровень ДА (в 3,7 раза), а у самцов – уровень НА в (1,8 раза). Как при самостоятельном росте меланомы В16/F10, так и особенно в модели ПМЗО выявлены статистически значимые изменения уровня катехоламинов в коре головного мозга мышей, степень выраженности которых зависит от пола животных и, возможно, играет определенную роль в агрессивности злокачественного процесса, обусловливая значительно больший размер опухолей у самок, обладающих меньшей стрессоустойчивостью.

Полученные нами данные согласуются с представлениями о роли катехоламинов головного мозга в регулировании стресс-реак-ции и значимости хронического стресса для злокачественного роста. Первичным, на наш взгляд, является злокачественный рост.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Франциянц Е.М., Каплиева И.В.

Планирование эксперимента: Каплиева И.В.

Сбор, обработка экспериментального материала: Трепитаки Л.К., Погорелова Ю.А.

Проведение ИФА-анализа: Немашкалова Л.А., Погорелова Ю.А.

Статистическая обработка данных: Горошинская И.А.

Анализ и интерпретация данных: Горошинская И.А., Каплиева И.В.

Написание и редактирование текста: Горошинская И.А., Каплиева И.В.