Содержание и состав липидов в листьях растений на Южном Тимане (ботанический заказник «Сойвинский»)

В настоящее время вопросы выявления, оценки и рационального использования растительных ресурсов приобретают особое значение. Для рационального использования ресурсов важно не только оценивать запасы сырья и содержание целевого продукта, необходимо более полное знание об их эколого-биологических и биохимических свойствах. Среди растений природной флоры таежной зоны Республики Коми большой интерес представляет Aconitum septentrionale Koelle (аконит высокий), Astragalus danicus Retz. (астрагал датский) и Medicago lupulina L. (люцерна хмелевидная).

Липиды – один из основных классов биомолекул, которые являются структурной основой клеточных мембран. Благодаря способности модулировать физические свой- ства мембран, выступать в роли сенсоров и сигнальных молекул, а также взаимодействовать с белками, влияя на их внутриклеточную локализацию и активность, липиды вносят существенный вклад в функционирование клеток [1-3]. Липиды участвуют в регуляции многих процессов, включая рост и деление клеток, мембранный транспорт, внутриклеточную сигнализацию и межклеточную коммуникацию, формирование ответных реакций на факторы среды [4]. Указанное многообразие функций липидов подчеркивает важность изучения данных соединений для характеристики свойств растений, изменения метаболизма в процессе их роста и/или при адаптации к условиям местообитания.

В данной работе приведены результаты изучения содержания липидов и жирных кислот в листьях трех видов многолетних травянистых растений, произрастающих на территории ботанического заказника «Сойвинский» (Южный Тиман).

Материалы и методы

Район исследований ( 62.74904° с. ш., 55.82610° в. д.) характеризуется умеренно-континентальным климатом с длинной, умеренно холодной зимой и коротким, умеренно теплым летом. Средняя температура самого теплого месяца – июля – +16–17° С. В период проведения исследований (первая декада июля) погода выдалась сравнительно прохладной с выпадением обильных осадков и высокой облачностью; среднесуточная температура была ниже нормы на 3–4° С.

Объектами исследования служили листья Aconitum septentrionale Koelle. (аконит высокий), Astragalus dani-cus Retz. (астрагал датский) и Medicago lupulina L. (люцерна хмелевидная). Растения A. septentrionale (сем. Ranunculaceae) произрастали в двух типичных для данного района cообществах на левом берегу р. Сойвы. Це-нопопуляция 1 (ЦП 1) охарактеризована как ельник круп-нотравно-злаковый, а ЦП 2 описана как сероольшанник аконитовый [5]. Растения ЦП 1 получали меньше света, чем растения ЦП 2. Растения A. danicus и M. lupulina (сем. Faboideae) обитали в разных по световому режиму условиях. Растения A. danicus произрастали в густом травостое на лугу, растения M. lupulina – на хорошо освещенном участке, вдоль дороги. Растения всех изученных видов находились в фазе цветения.

Образцы листьев отбирали в утренние часы, высушивали в сушильном шкафу при температуре +80° С до постоянного веса и хранили в бумажных пакетах в сухом месте до проведения анализов. Перед анализом пробы листьев измельчали до порошковидного состояния с помощью аналитической мельницы «IKA A 11 basic» (Япония).

Выделение общих липидов (ОЛ) проводили методом Фолча [6]. Общие липиды экстрагировали из сухой массы листьев смесью хлороформ-метанол (2 : 1) из расчета 20 частей экстрагирующей смеси на одну часть ткани. Экстракцию осуществляли трижды при постоянном перемешивании. Полученный экстракт упаривали на ротационном испарителе «Heidolph Hei VAP Value G3» (Россия), в вакууме досуха при температуре не выше +40° С в предварительно взвешенных круглодонных колбах. Сухой остаток взвешивали и рассчитывали выход ОЛ. Содержание ОЛ выражали в мг/г сухой массы.

Для выделения фосфолипидов (ФЛ) сухой остаток ОЛ растворяли в минимальном количестве хлороформа. К раствору добавляли охлажденный в морозильной камере ацетон до появления мутного осадка и оставляли в морозильной камере для оседания ФЛ. Затем смесь фильтровали через предварительно взвешенные бумажные фильтры, высушивали в сушильном шкафу и взвешивали. Содержание ФЛ выражали в мг/г сухой массы.

Для извлечения нейтральных липидов (НЛ) использовали неполярный растворитель – гексан. С целью наиболее полного перехода исследуемых липидов в органическую фазу навески высушенных образцов листьев подвергали трехкратной экстракции при постоянном перемешивании. Экстракт фильтровали и упаривали на ротационном испарителе «Heidolph Hei VAP Value G3» (Россия) в вакууме досуха при температуре не выше +40° С в предварительно взвешенных круглодонных колбах. Сухой остаток взвешивали, рассчитывали выход нейтральных липидов [7].

Определение жирнокислотного состава общих липидов проводили путем их метилирования по методу [8]. Жирные кислоты (ЖК) определяли в виде их метиловых эфиров (МЭЖК) после проведения кислотного метанолиза липидов с последующей этерификацией выделившихся кислот. Метиловые эфиры разделяли на газовом хроматографе «КРИСТАЛЛ 2000М» (Хроматэк) с пламенно-ионизационным детектором в изотермическом режиме температуры термостата колонок (200° C) на кварцевой капиллярной колонке 30 м × 0,2 мм, газ-носитель – гелий, чистота – 99,99 %. Анализ высших ЖК проводили в экоана-литической лаборатории Института биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН. Регистрацию и обработку хроматограмм осуществляли с помощью системы сбора и обработки хроматографических данных «Хроматэк». Идентификацию и количественное определение МЭЖК проводили методом хромато-масс-спектрометрии на приборе «TRACE-DSQ» (Thermo Fisher Scientific, США) в режиме полного ионного тока (энергия электронов: 70 эВ). Сканирование МЭЖК осуществляли в диапазоне от 30 до 650 массовых чисел.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 10 («StatSoft Inc.», США). Значимость различий между средними значениями измеряемых показателей оценивали с применением критерия Стьюдента. Расчеты осуществляли при заданном уровне значимости р ≤ 0,05. В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические значения со стандартной ошибкой.

Результаты и их обсуждение

На рис. 1 представлены сравнительные данные о содержании липидов в листьях растений A. septentrionale из разных ценопопуляций. В ельнике крупнотравно-зла-ковом (ЦП 1) содержание липидов в сухой массе листьев A. septentrionale превышало 10 %, тогда как в серооль-шаннике (ЦП 2) величина этого показателя была достоверно ниже и составляла около 7 %. Растения из ЦП 1 и ЦП 2 не отличались достоверно по содержанию фосфо- и нейтральных липидов, на долю которых приходилось соответственно около 3 и 1 % сухой биомассы листьев. Однако относительное содержание ФЛ и НЛ (в % от ОЛ) было существенно выше в листьях растений из ЦП 2, чем в листьях растений из ЦП 1 (табл. 1). Вклад ФЛ и НЛ в пул ОЛ у листьев растений ЦП 2 составлял 39 и 13 %, а в листьях растений ЦП 1–27 и 11 % соответственно.

Рисунок 1. Содержание и состав липидов в листьях растений Aconitum septentrionale , произрастающих в ельнике крупнотравно-злаковом (ЦП 1) и сероольшаннике (ЦП 2).

Условные обозначения. Здесь и в рис. 2: ОЛ – общие липиды; ФЛ – фосфолипиды; НЛ – нейтральные липиды. * статистически значимые различия исследуемого показателя (р ≤ 0,05).

Figure 1. The content and composition of lipids in the leaves of Aconitum septentrionale plants growing in large-herb-cereal spruce forest (ЦП 1) and grey alder forest (ЦП 2).

Keys. Here and in Figure 2: ОЛ – total lipids; ФЛ – phospholipids; НЛ – neutral lipids. * statistically significant differences in the studied parameter (р ≤ 0.05).

Таблица 1

Относительное содержание нейтральных и фосфолипидов в листьях растений Aconitum septentrionale из разных ценопопуляций (% от суммы общих липидов)

Table 1

Relative content of neutral and phospholipids in the leaves of Aconitum septentrionale plants from different coenopopulations (as a percentage of the total lipid content)

Местообитания / Habitats	Фосфолипиды	Нейтральные липиды
Ельник крупнотравно-злаковый	27,1±1,0	11,2±1,0
Сероольшанник	39,2±2,2*	13,1±3,3

Условное обозначение. Здесь и в табл. 2: * статистически значимые различия исследуемого показателя (р ≤ 0,05).

Key. Here and in Table 2: * statistically significant differences in the studied parameter (р ≤ 0.05).

Изучение липидов у двух видов бобовых показало, что содержание липидов в сухой массе листьев растений A. danicus , обитающих на лугу в густом травостое составляло около 12 % сухой биомассы (рис. 2). Содержание ФЛ и НЛ в листьях A. danicus составляло соответственно около 3 и 1,5 % сухой биомассы. Содержание липидов в растениях M. lupulina , произрастающих вдоль дороги, на открытом участке составляло чуть более 7 % сухой биомассы листьев. Содержание ФЛ и НЛ в листьях A. danicus составляло соответственно около 3 и 1,5 % сухой биомассы. Содержание ФЛ и НЛ в листьях растений M. lupulina мало отличалось от данных показателей в листьях A. danicus . Однако на долю ФЛ в листьях M. lupulina приходилось почти 45 % ОЛ, тогда как у листьев A. danicus вклад ФЛ в ОЛ был вдвое меньше (табл. 2). Значимых различий в относительном содержании НЛ у листьев исследованных видов бобовых не обнаружено.

Липиды включают разнообразные жирные кислоты (ЖК). Исследования листьев бобовых растений показало наличие в их составе девяти ЖК, причем концентра-

Рисунок 2. Содержание и состав липидов в листьях Astragalus danicus и Medicago lupulina .

Figure 2. Content and composition of lipids in the leaves of Astragalus danicus and Medicago lupulina .

Таблица 2

Относительное содержание нейтральных и фосфолипидов в листьях растений Astragalus danicus и Medicago lupulina (% от суммы общих липидов)

Table 2

Relative content of neutral and phospholipids in the leaves of Astragalus danicus and Medicago lupulina plants (as a percentage of the total lipid content)

Виды Фосфолипиды Нейтральные липиды Astragalus danicus 22,7±1,5 14,4±2,1 Medicago lupulina 43,6±1,7* 17,0±1,0 ция трех была очень низкой (менее 1 % всех ЖК). Среди остальных ЖК идентифицированы две насыщенные (НЖК) и четыре ненасыщенные (ННЖК), которые вносили основной вклад в пул ЖК. На долю трех ЖК – пальмитиновой (C16:0), линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:3), приходилось свыше 90 % пула ЖК (табл. 3). Доля стеариновой ЖК (С18:0) составляла около 4 %, примерно такой же вклад вносили мононенасыщенные ЖК – пальмитолеиновая (С16:1) и олеиновая (С18:1).

Липиды являются основным структурным компонентом мембран, входят в состав запасных веществ. Содержание общих липидов в сухой массе листьев варьирует в зависимости от вида и условий произрастания растений. Общие липиды обычно представляют собой смесь полярных (глико- и фосфолипиды) и нейтральных липидов [4]. Структурной основой всех клеточных мембран являются фосфо- и гликолипиды [9]. Помимо них, в составе мембранных липидов присутствуют также стерины и сфинголипиды. Фосфолипиды являются главными липидами плазмалеммы, митохондрий и других эндомембран. Мем-

Таблица 3

Содержание жирных кислот в листьях Astragalus danicus и Medicago lupulina , % от суммы высших жирных кислот общих липидов

Table 3

Fatty acid content in the leaves of Astragalus danicus and Medicago lupulina , % of the higher fatty acid content of total lipids

Виды Насыщенные ЖК Ненасыщенные ЖК С16:0 С18:0 С16:1 С18:1 С18:2 С18:3 Astragalus danicus 20,8 4,0 1,9 2,9 18,1 52,1 Medicago lupulina 24,4 4,1 1,3 3,1 26,4 40,8 браны пластид содержат преимущественно галактогли-церолипиды, относящиеся к классу гликолипидов [3, 10]. Гликолипиды содержат высокие концентрации полине-насыщенных ЖК. К нейтральным липидам относят триглицериды, воски, эфиры стеринов, N-ацилэтаноламиды, церамиды. Триглицериды являются основной группой липидов, участвующих в запасании энергии, и предшественниками важных компонентов липидного обмена [11].

Нами получены данные об общем содержании липидов, фосфолипидов и нейтральных липидов в листьях трех видов растений, обитающих в различных условиях на территории заказника «Сойвинский» (Южный Тиман).

Результаты исследования показали, что содержание и соотношение липидов в листьях Aconitum septentrionale зависело от условий местообитания растений. Концентрация всех исследованных групп липидов была выше в листьях растений, произрастающих в ельнике круп-нотравно-злаковом. Листья растений A. septentrionale , обитающего в сероольшаннике, содержали на 36 % меньше ОЛ. В то же время растения достоверно не отличались по содержанию фосфо- и нейтральных липидов, доля которых составляла соответственно 3 и 1 % сухой биомассы листьев. Однако суммарный вклад ФЛ и НЛ в пул ОЛ листьев растений ЦП 2 был в 1,4 раза больше, чем в листьях растений ЦП 1, и составлял 52 %.

Анализ данных, полученных при исследовании липидов Astragalus danicus и Medicago lupulina , выявил различия между этими видами. Растения A. danicus , обитающие в густом травостое, содержали больше липидов, чем растения M. lupulina , произрастающие на открытом месте вдоль дороги. При этом суммарный пул ФЛ и НЛ в листьях люцерны хмелевидной составлял более 60 %, а астрагала датского – 37 % от содержания ОЛ. Изучение жирнокислотного состава выявило тенденцию к снижению соотношения ННЖК и НЖК в листьях M. lupulina , что свидетельствует о более высокой доле НЖК в пуле ЖК листьев у этого вида по сравнению с A. danicus .

В совокупности эти результаты позволяют полагать, что как в случае с двумя ценопопуляциями A. septentrionale, так и в случае с двумя видами бобовых одной из основных причин различия в содержании и качественном составе липидов являются условия местообитания, сглаживающие возможные межвидовые различия. Местообитания отличались по обеспеченности растений важнейшим для фотоавтотрофных организмов ресурсом – фотосинтетической радиацией. Свет является не только драйвером фотосинтеза, но и регулятором многих процессов жизнедеятельности, включая рост и развитие растений. Тот факт, что растения, получающие меньше света, содержали больше липидов, а суммарный вклад ФЛ и НЛ в липидный пул у них был ниже, вероятно, отражает более высокое содержание гликолипидов, связанных с пластидными мембранами. По имеющимся в литературе сведениям, 1 г листьев может содержать до 1 м пластидных мембран [12]. Доля пластидных липидов – глицеролипидов у арабидопсиса – составляла более 50 % всех липидов листа [9]. У исследованных нами растений вклад глицеролипидов в ОЛ листьев может варьи- ровать от 45 до 60 % в зависимости от светового режима местообитания. По-видимому, различия достигаются за счет повышенного содержания гликолипидов в листьях A. septentrionale и A. danicus, произрастающих в условиях более низкого поступления световой радиации. Это согласуется с данными об отличиях световых и теневых растений A. septentrionale по удельной поверхностной плотности листьев и содержанию фотосинтетических пигментов [13].

Растения способны синтезировать более чем 200 различных ЖК. Мы идентифицировали в листьях исследованных видов девять высших ЖК. Модификации пула ЖК отводят важную роль в процессах адаптации растений к условиям произрастания [14]. В литературе имеются данные, свидетельствующие о значении количественных и качественных изменений ЖК для репарации ФС II при фотоингибировании [15]. Изменение состава и содержания ЖК является одним из механизмов поддержания микровязкости плазмалеммы в определенных пределах. Широкий диапазон изменчивости содержания различных ЖК связан как с видовыми особенностями, так и с условиями обитания растений [3, 16, 17]. Нами выявлена тенденция к изменению соотношения ННЖК и НЖК у бобовых видов растений, произрастающих в условиях различного светового режима. Растения на открытых участках, как правило, получают не только больше света, но и тепла. Поэтому снижение относительного содержания ННЖК и повышение НЖК в листьях M. lupulina можно рассматривать как адаптивную реакцию. Насыщенные жирные кислоты уменьшают текучесть мембран и снижают опасность их повреждения в результате перекисного окисления липидов.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о влиянии местообитания на липидный комплекс растений и значимости изучения изменений в содержании и составе липидов для понимания механизмов адаптации растений к условиям окружающей среды.