Содержание и спектр внутриэритроцитарных пептидов в условиях повышенния концентрации ЦАМФ

цАМФ в этом случае будет сопровождаться увеличением производства пептидных соединений внутри эритроцитарных клеток и, возможно, изменением спектра генерируемых соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проводилась на эритроцитах крови человека, предоставленной Самарской областной станцией переливания крови. Объектом исследования служила чистая фракция эритроцитов человека, разделенная по возрасту на молодые и старые клетки [4]. Чистоту фракций определяли, используя индекс фильтруемости эритроцитов [5], и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [6].

Фракции эритроцитов помещали в среду Рингера-Локка в отношении 1:1. Для изучения действия эндогенного цАМФ в пробы добавляли раствор адреналина в конечной концентрации 10 мкг/мл, превышающей физиологическую в 5-10 раз. В других пробах для блокирования фосфодиэстеразы цАМФ клетки инкубировали с имидазолом в концентрации 43 мкг/мл при 370С в течение 10 мин. с 400 мкг/мл тритона. Кроме того, к инкубационным пробам, содержавшим имидазол (43 мкг/мл) кратковременно добавляли раствор адреналина (10 мкг/мл). Для прекращения действия сигнальных молекул, в пробы в двухкратном объеме добавлялся физиологический раствор и пробы центрифугировали при 600 g 10 мин. Затем супернатант убирали, а белки осаждали 10% ТХУ, добавляя к суспензии эритроцитов в отношении 1:2, и центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. В надосадочной жидкости (ТХУ-экстракта) каждой пробы определяли содержание пептидных соединений по методу Лоури [7] и по УФ-поглощению ТХУ экстрактов (254 нм), с добавлением фосфатного буфера (pH 7,2) для нейтрализации излишней кислотности проб. Измерение оптической плотности производили на спектрофотометре СФ-46. 0,5 мл ТХУ-экстракта каждой пробы фракции эритроцитов после воздействия адреналина и имидазола совместно и поотдельности исследовали с помощью гель-хроматографии (колонка 8×190 мм, заполненная сефадексом G-10; 0,1М фосфатный буфер pH 6,86 в качестве подвижной фазы, скорость элюции 0,5

мл/мин). Детекцию проводили при длине волны 254 нм. Результаты выражали в усл.ед. - ОПх1000.

Для статистической обработки результатов использовали критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Верификация качества разделения эритроцитов на фракции молодых и старых клеток показала, что индекс фильтруемости во фракции старых эритроцитов отличался почти в два раза, а активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы была ниже на 2627%, что свидетельствовало о качественном разделении исходной популяции эритроцитов на фракции, содержащие преимущественно молодые и преимущественно старые клетки (табл. 1).

Действие высоких концентраций адреналина (10 мкг/мл) сопровождалось увеличением содержания пептидов внутри молодых клеток (мкг/мл) на 50% и увеличением УФ-поглощения на 23%. (табл. 2).

Таблица 1. Индекс фильтруемости и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы молодых и старых эритроцитов человека

Примечание: * - указано количество фракций, выделенных из крови разных доноров. ** - Е - международная единица активности ферментов. *** - достоверность различий р<0,01.

Таблица 2. Содержание пептидных соединений и УФ-поглощение ТХУ-экстрактов фракций эритроцитов (n=10)

Примечание: * - достоверность различия р<0,05; ** - достоверность различия р<0,01; *** - достоверность различия р<0,001.

Фракция старых эритроцитов в ответ на действие высоких концентраций адреналина не давала достоверного повышения содержания пептидов (мкг/мл), хотя регистрировалось увеличение УФ-поглощения проб на 19%. Возможно, это объясняется ухудшением метаболических процессов в клетках и нарушениями в мембранной рецепции [8].

Проведенные нами исследования хроматограмм пептидов, выделенных из эритроцитов с хроматограммами пептидов полученных инкубацией гемоглобина с пепсином доказывают гемоглобиновое происхождение эритроцитарных пептидных соединений [9,10]. Полученные данные позволили предполагать возможность активации процессов гидролитического расщепления гемоглобина цАМФ через цАМФ-зависимые протеинкиназы. Для увеличения внутриклеточной концентрации цАМФ мы блокировали фосфодиэстеразу цАМФ имидазолом.

Повышение концентрации внутриклеточного цАМФ за счет блокирования фосфодиэстеразы цАМФ имидазолом (43 мкг/мл) сопровождалось как увеличением УФ-поглощения экстрактов эритроцитов, так и содержания пептидов, регистрируемых по методу Лоури. Во фракции молодых эритроцитов количество пептидов повышалось на 30%, а во фракции старых - на 14%.

Добавление к пробам, содержавшим имидазол, раствора адреналина приводило к увеличению как содержания пептидных соединений, так и УФ-поглощения экстрактов. У молодых клеток содержание пептидов повышалось на 37% по сравнению с пробами, содержавшими только имидазол и на 19% по сравнению с пробами, на которые воздействовали только адреналином (табл. 2).

Активация адренорецепции не только увеличивает производство пептидов внутри клеток, но и, как показали данные гель-хроматографии изменяет их спектр (рис.). При действии адреналина удается обнаружить дополнительный пик, который присутствует во всех пробах содержавших адреналин. Второй пик, характерный для всех проб, показал достоверное увеличение содержания пептидных соединений в пробах с повышенной внутриклеточной концентрацией цАМФ по сравнению с контрольными пробами (рис.).

Рис. Гель-хроматография пептидных экстрактов фракции молодых эритроцитов (у.е.)

Если рассматривать спектр полученных пептидных соединений по массам, то в пробах, содержавших адреналин имелся дополнительный пик, свидетельствующий о наличии пептидных соединений предположительно массой 700–1000 Да, тогда как первый пик, представленный во всех пробах, вероятно, принадлежит пептидам массой от 1000 Да и выше.

Ускорение производства пептидных соединений эритроцитами в условиях активации адренорецепции, а также изменение их спектра, имеет важное регуляторное значение. Дальнейшее изучение этого явления, анализ спектра пептидов эритроцитов и их биологической активности представляет, на наш взгляд, существенный теоретический и практический интерес.

ВЫВОДЫ

• 1.    Повышение уровня эндогенного цАМФ в эритроцитах сопровождается увеличением количества пептидов и изменением их спектра при наличии гормонального сигнала. Эффект зависит от состояния мембранной рецепции и метаболических систем клетки, и обнаруживается только у молодых эритроцитов.

• 2.    Увеличение эндогенного цАМФ за счет ингибирования фосфодиэстеразы цАМФ в отсутствии гормонального сигнала сопровождается повышением концентрации внутриэритроцитарных пептидов. Уровень повышения зависит от возраста клетки, у молодых клеток процент повышения больше.

• 3.    Совместное воздействие на клетку гормонального сигнала с блокированием фосфодиэстеразы цАМФ приводит к суммированию эффекта – усилению повышения содержания пептидных соединений внутри эритроцитов и изменению их спектра.