Содержание интерлейкина 6 у здоровых и больных эссенциальной артериальной гипертензией с разными генотипами по -572G>C полиморфному маркеру гена IL6

В последнее время появляется все больше данных о том, что провоспалительные цитокины, в том числе и интерлейкин 6 (IL6), могут вносить значительный вклад в этиологию и патогенез различных ССЗ [14]. Так, у здоровых доноров, имеющих повышенный уровень IL6, отмечено увеличение риска развития ишемической болезни сердца (ИБС), инфаркта миокарда (ИМ)

и гипертонии [11]. В плазме пациентов с различными кардиоваскулярными расстройствами концентрация данного цитокина, как правило, выше, чем у доноров контрольной группы [10]. Более того, повышенная продукция этого белка часто ассоциируется с неблагоприятным прогнозом для пациентов с ССЗ, например пациентов, перенесших инсульт и инфаркт миокарда [20]. По всей

видимости, IL6 играет важную роль и в развитии ЭАГ. Так, в ряде исследований выявлена корреляция уровня этого белка со значениями систолического и диастолического давления у здоровых доноров и гипертоников [2], [4]. Известно, что экспрессия гена IL6 и концентрация кодируемого им белка в плазме могут определяться не только развитием воспалительного процесса в организме, но и наличием однонуклеотидных замен в разных областях гена [7], [15]. Мутации в промоторе гена могут привести к изменению связывания с этой областью ДНК транскрипционных факторов и в итоге к снижению или, напротив, повышению его транскрипционной активности [15]. Наиболее изучено влияние –174G>C полиморфизма гена IL6 на уровень его экспрессии и развитие ряда сердечно-сосудистых патологий [7]. Связь однонуклеотидной замены в положении –572 промоторной части этого гена с ССЗ исследована в меньшей степени. Показано влияние –572 G>C полиморфизма на продукцию IL6 как in vivo , так и in vitro [15], что предполагает наличие генетической предрасположенности доноров, имеющих соответствующие генотипы по данному полиморфному маркеру, к ряду заболеваний, в том числе и заболеваниям, сопровождающимся повышением кровяного давления. Тем не менее выяснилось, что сведения о содержании IL6 в плазме крови в зависимости от генотипа, так же как и данные о связи –572G>C полиморфного маркера гена IL6 с развитием ряда сердечно-сосудистых патологий, весьма противоречивы [13], [19], [22]. Контрастные результаты по ассоциации этого полиморфизма с развитием ССЗ получены для одних и тех же популяций [22]. Добавим к тому же, что исследования, посвященные изучению роли данного полиморфизма в развитии ЭАГ, малочисленны. В связи с этим целью исследования явилось изучение связи полиморфного маркера –572G>C гена IL6 с содержанием IL6 и развитием ЭАГ (I–II стадии) (на примере жителей Карелии).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для генотипирования доноров русской национальности использовано 266 образцов крови (139 образцов из контрольной группы (возраст 51,6 ± 3,9 года); 127 образцов из группы пациентов с ЭАГ (I–II стадии) (возраст 57,9 ± 2,3 года)). Диагноз ЭАГ был установлен впервые врачами ГБУЗ «Больница скорой медицинской помощи» г. Петрозаводска в соответствии и с учетом клинических рекомендаций Всероссийского научного общества кардиологов [1]. Обследование доноров, включенных в дальнейшем в контрольную группу, проводилось также врачами ГБУЗ «Больница скорой медицинской помощи» г. Петрозаводска в ходе диспансеризации. Образцы крови у представителей карельской и вепсской национальностей были собраны в ходе плановой диспан- серизации врачами Республиканской больницы им. Баранова в 2013 году. Возраст обследованных групп: карелы – 56,6 ± 1,88 года, вепсы – 57,5 ± 2,48 года. Критерии исключения из исследования: наличие сахарного диабета, перенесенные в последний месяц инфекционно-воспалительные заболевания, курение табака, беременность и лактация, алкогольная зависимость, индекс массы тела ≥ 30 кг/м2. Дополнительный критерий исключения из биохимического анализа – гипотензивная терапия. ДНК выделяли с помощью набора AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit («Axygen», США). Генотипирование проводилось методом ПЦР–ПДРФ. Для амплификации –572 промоторной части гена IL6 использовали праймеры, описанные в работе [16]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплифи-каторе iCycler iQ5 (Bio-Rad, США), используя реакционную смесь Master Mix (ThermoFisher, Германия). ПЦР-продукты обрабатывали эндонуклеазой рестрикции MbiI (1 e. a.) («Fermentas», Латвия) в течение 3 ч. при 37 ºС и разделяли в 2 % агарозном геле, используя трис-ацетатный буфер. Содержание IL6 в плазме крови определяли им-муноферментным методом (ИФА) с использованием тест-систем «Вектор-Бест» (Россия). Забор крови проводили утром натощак. Результаты исследования регистрировались на анализаторе «Sunrise» («Tecan», Швейцария). Для ИФА группы сравнения составили: 39 здоровых жителей Республики Карелия, подобранных по принципу случайной выборки, не имевших на момент обследования клинических признаков гипертонии (из них 10 мужчин и 29 женщин), и 26 пациентов с установленным диагнозом ЭАГ (I–II стадии) (из них 13 мужчин и 13 женщин). Возраст доноров контрольной группы составил 35,7 ± 7,3 года, пациентов с диагнозом ЭАГ 40,6 ± 2,66 года. Статистическая обработка материала проведена c использованием программного обеспечения StatGraphics 2.1. Достоверность различий частот аллелей и генотипов в группах оценивали с помощью критерия χ2, биохимических показателей между группами с помощью непараметрического критерия U Вилкоксона – Манна – Уитни. Различия считали достоверными при значении p < 0,05. Показатели концентрации IL6 приведены в виде средних, со стандартной ошибкой средних для двух выборок.

Исследования выполнены на оборудовании ЦКП ИБ КарНЦ РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате исследования показано, что уровень IL6 у пациентов с ЭАГ (I–II стадии) был выше, чем у доноров контрольной группы (табл. 1). Однако эти различия оказались статистически недостоверны (р = 0,06). Повышенное содержание данного цитокина у лиц, страдающих ЭАГ, регистрировали как у мужчин, так и у женщин (табл. 1). Содержание IL6 в плазме крови доноров всех исследуемых групп, имеющих разные генотипы по –572G>C маркеру гена IL6, достоверно не различалось (р = 0,82) (табл. 2).

Таблица 1

Содержание IL6 в контрольной группе и группе пациентов с ЭАГ

Группа	Концентрация IL6, среднее значение, пг/мл	Медиана	Минимум	Максимум
Контроль (n = 39)	14,61 ± 1,63	11,25	1,69	40,7
ЭАГ (n = 26)	16,71 ± 1,52	16,13	5,89	32,13
Мужчины контроль (n = 10)	14,22 ± 2,53	15,95	1,69	25,75
Мужчины ЭАГ (n = 13)	16,44 ± 2,31	15,38	5,89	32,13
Женщины контроль (n = 29)	14,74 ± 2,06	11,07	2,5	40,7
Женщины ЭАГ (n = 13)	16,96 ± 2,17	17,38	7,5	28,5

Таблица 2

Содержание IL6 в контрольной группе и группе пациентов с ЭАГ в зависимости от генотипа по –572G>C полиморфному маркеру гена IL6

Генотип	Концентрация IL6, среднее значение, пг/мл	Медиана	Минимум	Максимум
GG (n = 50, 71 %)	15,4 ± 1,34	13,12	1,7	40,7
GC + CC (n = 20, 29 %)	9,14 ± 2,69	6,14	3,4	21,75

Проанализированы частоты –572G>С полиморфного маркера гена IL6 в контрольной группе и группе пациентов с ЭАГ (I–II стадии), а также среди лиц русской, вепсской и карельской национальностей. Частоты аллелей и генотипов по 572G>С полиморфному маркеру гена IL6 не различались во всех исследуемых этнических группах (табл. 3). Значения χ² (соответственно для аллелей и генотипов): при сравнении группы русских и вепсских жителей Республики Карелия – 0,404 (df = 1, p > 0,05), 1,890 (df = 2, p > 0,05); при сравнении группы русских и карелов – 1,090 (df = 1, p > 0,05), 4,040 (df = 2, p > 0,05); при сравнении группы вепсов и карелов – 0,083 (df = 1, p > 0,05), 0,805 (df = 2, p > 0,05).

В исследуемых группах нами проводился тест на соответствие распределения равновесию Харди – Вайнберга. Несоответствие распределения равновесию Харди – Вайнберга по маркеру –572G>C обнаружено во всех исследуемых группах. Русские (контроль + ЭАГ): χ2 = 58,28 (df = 2, p < 0,001); русские (контроль): χ2 = 20,04 (df = 2, p < 0,001); русские (ЭАГ): χ2 = 18,87 (df = 2, p < 0,001); вепсы: χ2 = 26,69 (df = 2, p < 0,001); карелы: χ2 = 194,40 (df = 2, p < 0,001).

Таблица 3

Распределение аллелей и генотипов по полиморфному маркеру –572G/C гена

IL6 в группе людей, страдающих ЭАГ, и в контрольной группе русской, вепсской и карельской национальностей

Националь-ность	Группы	Аллели			Генотипы		Критерий χ2
		G	C	GG	GC	CC	аллели	генотипы
Русские	Контроль (n = 127)	0,93	0,07	0,9	0,07	0,03	0,474 (df = 1, p > 0,05)	0,400 (df = 2, p > 0,05)
	ЭАГ (n = 139)	0,95	0,05	0,92	0,06	0,02
Вепсы	Контроль (n = 18)	0,94	0,06	0,89	0	0,11	0,995 (df = 1, p > 0,05)	3,103 (df = 2, p > 0,05)
	ЭАГ (n = 24)	0,84	0,16	0,83	0,13	0,04
Карелы	Контроль (n = 25)	0,92	0,08	0,94	0	0,06	0,649 (df = 1, p > 0,05)	2,190 (df = 2, p > 0,05)
	ЭАГ (n = 17)	0,84	0,16	0,81	0,06	0,125

Как видно из табл. 4, распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера –572G>C гена IL6 не отличалось в группах здоровых и больных ЭАГ. Встречаемость аллелей и генотипов у пациентов с диагнозом ЭАГ и здоровых доноров достоверно не различалась во всех этнических группах (табл. 3, 4).

Таблица 4

Распределение аллелей и генотипов по полиморфному маркеру –572G/C гена IL6 в русской, вепсской и карельской этнических группах

		Русские (n = 266)	Вепсы (n = 45)	Карелы (n = 42)
Аллели	G	0,94	0,915	0,897
	C	0,06	0,085	0,103
Генотипы	GG	0,91	0,86	0,88
	CG	0,06	0,07	0,03
	CC	0,03	0,07	0,09

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время большое внимание уделяется значению воспалительных процессов в развитии и прогрессировании атеросклероза и различных середечно-сосудистых патологий, в том числе артериальной гипертензии и ишемической болезни сердца [8]. Одним из провоспалительных цитокинов является IL6, синтезирующийся фибробластами, моноцитами, адипоцитами, эндотелиальными клетками, Т- и В-лимфоцитами [14]. Он способен стимулировать продукцию белков острой фазы воспаления, а также усиливать адгезию клеток эндотелия сосудов. Повышенный уровень IL6 может вызвать увеличение концентрации активных форм кислорода, изменения в составе липидов и их окисленных форм, способствуя атерогенезу [6]. К тому же этот цитокин может модулировать уровень компонентов ренин-ангиотензин-альдо-стероновой системы, контролирующей давление крови в организме. Например, он индуцирует усиление экспрессии рецепторов ангиотензина II, способствует увеличению содержания ангиотен-зин-превращающего фермента и альдостерона в плазме крови [12]. Поэтому не удивительно, что повышенный уровень IL6 в плазме крови здоровых молодых мужчин и женщин может в будущем увеличить риск развития инфаркта миокарда [11]. О роли данного провоспалительного белка в этиологии и патогенезе ССЗ свидетельствует ряд фактов. Так, у больных с некоторыми сердечно-сосудистыми патологиями наблюдается гиперпродукция этого цитокина [10]. Плохой прогноз для пациентов, перенесших инсульт и инфаркт, может определяться плазменным уровнем IL6 [20]. Вероятно, IL6 играет определенную роль в развитии ЭАГ. Так, у мышей, нокаутных по гену IL6, наблюдали более низкое систолическое давление после воздействия холода по сравнению с контрольными животными [5]. У гипертензивных пациентов, принимавших антагонист рецепторов ангиотензина II, ирбесартан, снижение артериального давления происходило одновременно с понижением в плазме IL6 [18]. У гипертоников отмечается увеличение содержания в плазме данного цитокина [3], однако не всегда достоверное [18]. В нашем исследовании отмечено небольшое повышение концентрации IL6 у больных ЭАГ по сравнению со здоровыми донорами.

Известно, что содержание цитокинов в плазме может изменяться с возрастом и зависеть от гормонального статуса доноров [14]. В связи с этим мы проанализировали уровень IL6 в плазме крови здоровых и больных ЭАГ доноров в зависимости от половой принадлежности. Содержание этого белка у мужчин и женщин в контрольной группе и группе с диагнозом ЭАГ практически совпадало. Причем как у мужчин, так и у женщин, больных ЭАГ, отмечено небольшое повышение уровня IL6. Полученные данные могут свидетельствовать о протекании воспалительных процессов в организме при данном заболевании [8].

Интересно, что базовый уровень IL6 у здоровых доноров может корреллировать со значениями систолического и диастолического давления крови [4]. В связи с этим предполагается, что повышение его содержания у здоровых доноров – один из факторов, обеспечивающих у них высокую вариабельность параметров кровяного давления и увеличение риска развития ЭАГ [4]. Уровень IL6 у здоровых людей может быть обусловлен генетически. Мутации в разных областях гена IL6 способны влиять как на уровень его транскрипционной активности, так и на содержание кодируемого им белка [15]. Так, замена гуанина на цитозин в –174 позиции промотора сопровождается снижением транскрипции этого гена [7]. Менее понятно влияние замены гуанина на цитозин в –572 позиции промотора гена IL6 на уровень его экспрессии. По данным Walston с соавторами, у белокожих американцев, носителей СС генотипа, уровень белка в плазме значительно выше, чем у лиц, имеющих GG генотип [19]. У здоровых жителей Кореи повышенный уровень IL6 ассоциировался с наличием GG генотипа [13]. В другом исследовании влияние однонуклеотидной замены в –572 положении промотора гена IL6 на содержание IL6 было выявлено у пациентов с болезнью коронарных артерий только после процедуры шунтирования аорты, которая, вероятно, стимулировала воспалительные процессы в организме [3]. Следовательно, данные о содержании этого белка в плазме крови в зависимости от генотипа весьма противоречивы.

Мы проанализировали содержание IL6 в плазме крови здоровых и больных ЭАГ доноров в зависимости от генотипа по –572G>С полиморфному маркеру гена IL6 . У обследованных нами доноров концентрация этого цитокина в плазме крови не зависела от генотипа.

Как отмечалось выше, в литературе встречаются противоположные данные и по ассоциации –572G>С полиморфного маркера гена IL6 с наличием ряда сердечно-сосудистых патологий. Так, в ряде исследований, проведенных среди представителей азиатских народов, показано увеличение риска развития ряда ССЗ у носителей G аллеля по данному полиморфному маркеру [9], [22]. Однако для белокожих европейцев и американцев ассоциация –572G>C полиморфизма гена IL6 с развитием кардиоваскулярных патологий не выявлена [19]. В своем исследовании мы проанализировали частоты –572G>С полиморфного маркера гена IL6 в контрольной группе и группе пациентов с ЭАГ. Показано, что частоты аллелей G и С, а также соответствующих им генотипов в двух сравниваемых группах среди русских, вепсов и карелов достоверно не отличаются. Следовательно, нами не выявлена ассоциация –572G>С полиморфного маркера гена IL6 с развитием ЭАГ (I–II стадии) у жителей Карелии. Отсутствие связи развития гипертонии с носительством того или иного генотипа по данному маркеру показано и в работе Wong с соавторами [21]. Противоречивые данные по связи указанного полиморфного маркера с кардиоваскулярными расстройствами как внутри, так и между европейской и азиатской популяциями можно объяснить различной частотой G и С аллелей. В азиатских популяциях G аллель является минорным [22]. Его относительная частота составляет 0,2–0,3 [9]. Среди представителей европейцев более распространен аллель G, а встречаемость аллеля C очень низкая [17], [19]. Вероятно, именно это и является основной причиной, по которой не удается выявить ассоциативную связь между носительством аллеля G или С и развитием кардиоваскулярных расстройств у европейцев и белокожих американцев. При- веденные факты говорят о том, что этническая принадлежность играет немаловажную роль в генетической предрасположенности к ССЗ. В связи с этим нами проведена оценка частот –572G>C полиморфного маркера среди представителей трех этнических групп Республики Карелия: русских, вепсов и карелов. Сравнительный анализ полученных результатов с данными литературы показал, что частоты аллелей и генотипов –572G>C маркера гена IL6 в трех представленных этнических группах Карелии близки к частотам, характерным для коренных европейцев [17]. Распределение частот аллелей и генотипов по данному маркеру среди русских, вепсских и карель- ских жителей Республики Карелия достоверно не различалось.

В целом, исходя из полученных результатов, можно заключить, что развитие ЭАГ (I–II стадии) сопровождается небольшим повышением уровня IL6 в плазме крови. Схожее распределение частот аллелей и генотипов по –572G>C полиморфному маркеру гена IL6 в двух группах сравнения, а также отсутствие различий в концентрации данного белка у доноров, имеющих разные генотипы, позволяют предположить, что исследуемый полиморфизм не вовлечен в генетическую предрасположенность русского, вепсского и карельского населения Карелии к развитию ЭАГ.

* Статья написана в рамках выполнения темы НИР ИБ КарНЦ РАН, № г. р. 0120135834 и при финансовой поддержке программы Президиума РАН на 2012–2014 гг. «Фундаментальные науки – медицине», № г. р. 01201262105; Гранта Правительства РФ по постановлению № 220, ГК № 11.G34.31.0052 (вед. ученый А. Н. Полторак).

REFFERENCES

• 1.    Diagnosis and treatment of hypertension. The Russian recommendation (IV review) / Russian medical society on hypertension. Russian scientific society of Cardiology [Diagnostika i lechenie arterial’noy gipertenzii. Rossiyskie rekomendatsii (IV peres-motr) / Rossiyskoe meditsinskoe obshchestvo po arterial’noy gipertonii. Vserossiyskoe nauchnoe obshchestvo kardiologov]. Sistemnye gipertenzii. 2010. № 3. P. 5–26.

• 2.    B aut i s t a L. E., Ver a L. M., A r e n a s I. A., G a m a r r a G. Independent association between inflammatory markers (C-reactive protein, interleukin-6, and TNF-α) and essential hypertension // J. Hum. Hypert. 2005. Vol. 19. P. 149–154.

• 3.    Brull D. J., Montgomery H. E., S ander s J., et al. Interleukin-6 gene –174G>C and –572G>C promoter polymorphisms are strong predictors of plasma interleukin-6 levels after coronary artery bypass surgery // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001. Vol. 21. P. 1458–1463.

• 4.    Сh ae C. U., L e e R. T., Ri fai N., Ridker P. M. Blood pressure and inflammation in apparently healthy men // Hypertension. 2001. Vol. 38. P. 399–403.

• 5.    Cro s s wh it e P., S un Z. RNAi knockdown of Interleukin-6 attenuates cold-induced Hypertension // Hypertension. 2010. Vol. 55. № 6. P. 1484–1491.

• 6.    F ernánd e z - Re al J. M., B ro ch M., Vendre l l J., et al. Interleukin 6 gene polymorphism and lipid abnormalities in healthy subjects // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000. Vol. 85. P. 1334–1339.

• 7.    F i sh m an D., Fauld s G., Je ffery R., et al. The effect of novel polymorphisms in the interleukin 6 ( IL-6 ) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis // J. Clin. Invest. 1998. Vol. 102. P. 1369–1376.

• 8.    H arr i s o n D. G., Guz i k T. J., L ob H., et al. Inflammation, Immunity and Hypertension // Hypertension. 2011. Vol. 57. № 2. P. 132–140.

• 9.    Jang Y., Kim O. Y., Hyun Y. J., et al. Interleukin-6–572C>G polymorphism – association with inflammatory variables in Korean men with coronary artery disease // Translational Research. 2008. Vol. 151. № 3. P. 154–161.

• 10.    M end al l M. A., A s ant e M., B al l am L., et al. Relation of serum cytokine concentrations to cardiovascular risk factors and coronary heart disease // Heart. 1997. Vol. 78. P. 273–277.

• 11.    R idker P. M., Henneke n s C. H., B uring J. E., Ri fai N. C-reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women // N. Engl. J. Med. 2000. Vol. 342. № 12. P. 836–843.

• 12.    S amue l s s o n A.-M., A l ex ande r s on C., Mölne J., et al. Prenatal exposure to interleukin-6 results in hypertension and alterations in the renin-angiotensin system of the rat // J. Physiol. 2006. Vol. 575. № 3. P. 855–867.

• 13.    Shin K.-K., Jang Y., Koh S. J., et al. Influence of the IL-6–572C>G polymorphism on inflammatory markers according to cigarette smoking in Korean healthy men // Cytokine. 2007. Vol. 39. P. 116–122.

• 14.    Stoner L., Luc e ro A. A., Palmer B. R., et al. Inflammatory biomarkers for predicting cardiovascular disease // Clinical Biochem. 2013. Vol. 46. P. 1353–1371.

• 15.    Terry C. F., L oukac i s V., Gre en F. R. Cooperative influence of genetic polymorphisms on interleukin-6 transcriptional regulation // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 18138–18144.

• 16.    Ti m a s h e v a Y. R., N a s ibu l l i n T. R., Z ak i rov a A. N., Mu s t a f i n a O. E. Association of Interleukin-6, Interleukin-12, and Interleukin-10 Gene Polymorphisms with Essential Hypertension in Tatars from Russia // Biochem. Genet. 2008. Vol. 46. P. 64–74.

• 17.    Varg a s -A l arc on G., Ram ı ´rez - B e l lo J., Ju a ´re z - C e di l lo T., et al. Distribution of the IL -1RN, IL-6, IL-10, INF-c, and TNF-a gene polymorphisms in the mexican population // Genetic testing and molecular biomarkers. 2012. Vol. 16. № 10. P. 1246–1253.

• 18.    Váz que z - O l iva G ., Fe r n ánde z - Re al J. M., Z am ora A., et al. Lowering of blood pressure leads to decreased circulating interleukin-6 in hypertensive subjects // J. Hum. Hypertens. 2005. Vol 19. P. 457–462.

• 19.    Wa l s ton J. D., Fa l l i n M. D., C u s hm an M., et al. IL-6 gene variation is associated with IL-6 and C-reactive protein levels but not cardiovascular outcomes in the Cardiovascular Health Study // Hum. Genet. 2007. Vol. 122. P. 485–494.

• 20.    Wh it el ey W., Jacks on C., Lewis S., et al. Inflammatory markers and poor outcome after stroke: A prospective cohort study and systematic review of interleukin-6 // PLoS Med. 2009. Vol. 6. № 9. e1000145. Аvailable at: www.plosmedicine.org/vol6/issue9/ 21. Wong L. Y., L eung R. Y., O ng K. L., Cheung B. M. Plasma levels of fibrinogen and C-reactive protein are related to interleukin-6 gene –572C>G polymorphism in subjects with and without hypertension // J. Hum. Hypertens. 2007. Vol. 21. P. 875–882.

• 22.    Z h e n g G. H., C he n H. Y., X i o ng S. Q. Polymorphisms of –174G > C and –572G >C in the interleukin 6 (IL-6) gene and coronary heart disease risk: a meta-analysis of 27 research studies // PLoS One. 2012. Vol. 7. e34839. Аvailable at: www. plosone.org/vol7/issue4/