Содержание эндотелина-1 и высокомолекулярного кининогена в крови больных раком молочной железы после перенесенной инфекции SARS-COV-2

Разразившаяся пандемия COVID-19 имела глубокое негативное воздействие на оказание специальной медицинской помощи онкологическим больным. Возникло много вопросов, связанных с взаимным влиянием онкологического и инфекционного процессов и их лечением, что способствовало активизации исследований в этой области [1, 2].

Инфекция, вызванная вирусом SARS-CoV-2, признана системным сосудистым заболеванием, приводящим к прокоагулянтному состоянию, гиперактивации воспаления и развитию эндотелиальной дисфункции [3–5]. Проникновение в клетку вируса SARS-CoV-2 происходит через связывание с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АПФ-2) на клеточной мембране эндотелиоцитов, который противодействует вазопрессорному эффекту ангиотензина [6]. Взаимодействие SARS-CoV-2 с АПФ-2 снижает активность фермента, что косвенно способствует активации пути калликреин-брадикинин, приводя к дилатации сосудов и увеличивая их про- ницаемость [7]. С другой стороны, в плазме крови существует биохимический механизм ограничения распространения инфекции, связанный с контролируемым воспалением, коагуляцией, увеличением проницаемости сосудов – плазматическая система контактной активации и калликреин-кининовая система, которые активируются при контакте с чужеродными микроорганизмами [8–10]. Комплекс ВМК с фактором XII и прекалликреином является центральным компонентом этой системы, связывая плазменную коагуляцию, фибринолиз, активацию комплемента, проявляя антикоагулянтные свойства [11]. В результате расщепления ВМК калли-креином образуется пептид брадикинин – один из самых мощных медиаторов воспаления, вазодилатации и проницаемости сосудов, участвующий в активации клеточных врожденных иммунных ответов. Ряд других продуктов расщепления ВМК стимулируют секрецию цитокинов и хемокинов мононуклеарными клетками человека, обладают антибактериальной и антигрибковой активностью, что также вносит вклад в развитие воспаления

• [10] . В литературе представлены убедительные доказательства участия кининов в инфекциях, вызываемых различными агентами, в том числе вирусными, а также при развитии COVID-19 [12]. Как показывают исследования (гипер)активация этих систем играет важную роль в патогенезе новой инфекции [13–16].

Формирующаяся при коронавирусной инфекции эндотелиальная дисфункция проявляется нарушением сосудистого баланса в сторону вазоконстрикции с последующей ишемией органов, воспалением и прокоагулянтным состоянием [4, 17]. Сильнодействующим вазоконстриктором является ЭТ-1, синтез которого в эндотелии индуцируется гипоксией и легочной инфекцией [18]. Клинические и экспериментальные данные показывают, что ЭТ-1, являясь провоспалитель-ным агентом, участвует в патогенезе сепсиса, бактериальной и вирусной пневмонии [19–22]. Кроме эффектов ЭТ-1 на гладкомышечные клетки сосудов известны его митогенные, апоптотические и иммуномодулирующие свойства, имеющие определенное значение при развитии онкологического процесса в организме [23]. Для ВМК и продукта его расщепления брадикинина также показано важное значение в ангиогенезе и росте опухоли [24, 25].

Целью исследования явилось изучение содержания ЭТ-1 и высокомолекулярного кининогена в крови больных РМЖ, перенесших новую коронавирусную инфекцию.

Материал и методы

В исследование включили 20 пациенток с локализованной и метастатической формами РМЖ в возрасте 30–80 лет (средний возраст 52,8 ± 3,9 года), находившихся на лечении в НМИЦ онкологии с июня по октябрь 2020 г. Гистологически у всех больных верифицирована инвазивная карцинома неспецифического типа. Распределение по стадиям: II стадия – у 9 (45 %), III стадия – у 6 (30 %), IV стадия – у 5 (25 %) больных; по степени дифференцировки: G1 у 5 (25 %), G2 у 10 (50 %), G3 у 5 (25 %); по молекулярному подтипу: люминальный А – у 4 (20 %), люминальный В HER2/neu негативный – у 4 (20 %), люминальный В HER2/neu позитивный – у 7 (35 %), тройной негативный – у 5 (25 %) пациенток. На момент инфицирования вирусом SARS-CoV-2 все больные получали системную полихимиотерапию (таксановые режимы – 5 пациенток, нетаксановые режимы – 15).

Все пациентки имели положительный результат на наличие антигена SARS-CoV-2 в мазке из носоглотки (метод RT-PCR в лаборатории НМИЦ онкологии). По степени тяжести COVID-19 больные были с бессимптомным течением (только положительный результат RT-PCR в мазке из носоглотки), с легким течением (повышение температуры тела до 38 ºС, боль в горле, кашель, отсутствие признаков вирусного поражения легких при КТ), с среднетяжелым течением (повышение температуры тела выше 38 ºС, одышка при легкой физической нагрузке, КТ-признаки вирусной пневмонии). Все пациентки получали лечение по поводу инфекции COVID-19 согласно клиническим рекомендациям в зависимости от тяжести течения заболевания: при легкой степени лечение проводилось амбулаторно, при стреднетяжелой – в условиях стационара, искусственной вентиляции легких не потребовалось.

После лечения по поводу COVID-19 для продолжения противоопухолевой терапии всех больных госпитализировали при наличии отрицательного результата на антиген SARS-CoV-2 в мазке из носоглотки, сбора эпидемиологического анамнеза, оценки жалоб больного, термометрии, пульсоксиметрии с измерением SPO2 и отсутствии признаков пневмонии по результатам спиральной компьютерной томографии органов грудной клетки. Период от положительного результата на антиген SARS-CoV-2 и до забора крови составил от 3 до 10 нед, в среднем – 5,7 нед.

Группу сравнения составили 19 женщин, сопоставимых по возрасту, без выявленной онкологической патологии, которые также перенесли новую коронавирусную инфекцию, подтвержденную наличием положительного результата на антиген SARS-CoV-2 в мазке из носоглотки (метод RT-PCR), и имеющие антитела IgG к вирусу SARS-CoV-2 (у 1 – среднетяжелое течение, у 3 – легкое течение, у 15 – бессимптомно, только положительный результат RT-PCR в мазке из носоглотки). Контрольную группу составили 10 женщин, сопоставимых по возрасту, без онкологической патологии, не имевших симптомов COVID-19 и не имеющих антител IgG к вирусу SARS-CoV-2. У всех участников исследования получено информированное согласие на использование биологического материала (кровь) в научных целях.

В основной группе женщины имели различную коморбидную патологию: гипертоническую болезнь различной степени тяжести (n=9), хроническую сердечную недостаточность (n=7), ожирение (n=7), сахарный диабет II типа (n=8), варикозную болезнь нижних конечностей, хронический пиелонефрит в стадии ремиссии, узловую миому матки и хронический гастродуоденит. У женщин из группы сравнения и контроля также отмечены гипертоническая болезнь, хроническая сердечная недостаточность, ожирение, сахарный диабет II типа, аутоиммунный тиреоидит.

В плазме крови, взятой утром натощак, ИФА-методом определяли содержание ЭТ-1 (R&D Systems, США) и высокомолекулярного кинино-гена (AssayPro, США). Статистическую обработку проводили в программе Statistica 6.0. Проверку на нормальность распределения данных в группах проводили с помощью критерия Шапиро–Уилка. В большинстве групп распределение отличалось от нормального, поэтому для единообразия все данные представлены в виде медианы, 25 и 75 процентилей (медиана (25 %; 75 %)). Значимость различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента или критерия Манна–Уитни, применяя поправку Бонферрони к уровню статистической значимости в связи с проведением множественных сравнений (для групп с нормальным и высоким содержанием ЭТ-1 – р=0,0085, в остальных случаях – р=0,017).

Результаты

При анализе уровня ЭТ-1 и высокомолекулярного кининогена в крови больных РМЖ и женщин из группы сравнения установлено, что в группе сравнения (женщины без онкологической патологии, перенесшие COVID-19) содержание ЭТ-1 не отличалось от уровня в контрольной группе, а содержание ВМК было в 3,4 раза выше (табл.). При этом надо учесть, что референсные значения для ВМК составляют 65–130 мкг/мл плазмы крови. В общей группе больных РМЖ содержание ЭТ-1 и ВМК не отличалось от уровня в группе сравнения, однако по сравнению с уровнем показателей в контрольной группе содержание ВМК было в 2,6 раза выше.

У 5 (25 %) больных РМЖ до инфицирования SARS-CoV-2 было выявлено метастатическое поражение легких, при этом средний возраст в этой группе был выше, чем средний возраст в группе сравнения. Содержание ЭТ-1 было выше уровня в группе сравнения в 1,8 раза, содержание ВМК не отличалось от показателя в группе сравнения, но было в 3,0 раза выше, чем в контроле (р=0,0209). У 15 (75 %) женщин без метастатического поражения легких до COVID-19 содержание ЭТ-1 не отличалось от его уровня в группе сравнения, а уровень ВМК был в 2,4 раза выше, чем в контроле.

Из 20 больных РМЖ у 11 (55 %) была зафиксирована среднетяжелая степень течения инфекции (COVID-пневмония), у 8 (40 %) – инфекция протекала бессимптомно, у 1 (5 %) – легкое течение (проявления ОРВИ без повышения температуры тела). При этом метастатическое поражение легких до инфицирования имелось как среди больных со среднетяжелым течением – у 3 (27,3 %), так и среди больных с бессимптомным и легким течением коронавирусной инфекции – у 2 (22,2 %). Независимо от степени тяжести проявления инфекции содержание ЭТ-1 и ВМК было сопоставимо с их уровнями в группе сравнения, при этом по сравнению с показателями в контрольной группе содержание ВМК было выше у всех больных в 2,3–2,8 раза (р=0,0186, р=0,0047).

Результаты изучения концентрации ЭТ-1 в крови у здоровых людей противоречивы, но известно, что она крайне невелика – не превышает 0,1–1 фмоль/мл плазмы крови (или может совсем не определяться) [26]. Исходя из этого мы проана- лизировали у обследованных женщин содержание ЭТ-1–21 и установили, что в контрольной и в группе сравнения ни у одной женщины оно не достигло значения 1 фмоль/мл=2,49 пг/мл, в группе больных РМЖ у 16 (80 %) женщин – было ниже уровня 1 фмоль/мл (ниже 2,49 пг/мл), т.е. находилось ниже референсного значения, а у 4 (20 %) больных – выше этого значения и составило в среднем 3,02 пг/мл, что оказалось в среднем в 3 раза выше показателя в контроле, в группе сравнения и в группе больных РМЖ с нормальным содержанием ЭТ-1–21. При этом у больных с нормальным уровнем ЭТ-1–-21 содержание кининогена было ниже, чем в группе сравнения и у больных с высоким содержанием ЭТ-1–21, в среднем в 1,8 раза (р=0,0076, р=0,0103), но выше, чем в контроле, в 2 раза (р=0,0297), почти достигая верхней границы референсного интервала. У больных с высоким уровнем ЭТ-1–21 содержание кининогена не отличалось от значений в группе сравнения и сохранялось выше, чем в контроле в 3,5 раза (р=0,0209). При этом только у 2 женщин из этой подгруппы имела место коморбидная патология – гипертоническая болезнь, хроническая сердечная недостаточность, сахарный диабет II типа, ожирение.

Обсуждение

Анализируя полученные результаты, можно отметить, что у женщин без онкологической патологии через 1–2 мес после перенесенной коронавирусной инфекции содержание ЭТ-1 не отличалось от уровня у здоровых женщин и находилось в пределах референсных значений, однако содержание ВМК на этом сроке было значительно более высоким. Только у больных РМЖ с метастатическим поражением легких до коронавирусной инфекции уровень ЭТ-1 был выше, чем у женщин без онкологической патологии после коронавирусной инфекции, у остальных больных РМЖ (при отсутствии метастазирования в легкие в анамнезе, легком течении инфекции или в виде пневмонии) уровень ЭТ-1 не отличался от показателей у женщин без онкологической патологии (болевших и не болевших COVID-19), при этом содержание этого метаболита у большинства обследованных больных РМЖ оставалось в пределах референсных значений. У всех женщин, перенесших инфекцию (группа сравнения, группа больных РМЖ), через 3–10 нед от момента получения положительного результата RT-PCR на антиген Sars-CoV-2 содержание ВМК все еще было значительно выше, чем у людей без инфекции (контрольная группа), и выше референсных значений, причем у больных РМЖ с более благоприятной клинической картиной (отсутствие метастазов в легкие, легкое течение инфекции) увеличение уровня ВМК было менее выражено (имеющееся ограничение – небольшая численность подгрупп – возможно, оказывает влияние на величину статистической значимости таблица/table

содержание в крови Эт-1 и высокомолекулярного кининогена у больных рМж the blood levels of endothelin-1 and high molecular weight kininogen in patients with breast cancer

Группы больных/Patients groups	Возраст, лет/ Age, years	ЭТ-1–21, пг/мл/ Endothelin 1–21, pg/ml	Высокомолекулярный кининоген, мкг/мл/ High molecular weight kininogen, µg/ml
Контрольная группа (n=10)/ Control group (n=10)	53,8 ± 9,5	1,136 (0,932; 1,242), N	70,7 (55,1; 88,1), N
Группа сравнения (n=19)/ Comparison group (n=19)	43,10 ± 17,1	0,90 (0,62; 1,23), N	213,0 (170; 288) р3=0,0027
Общая группа больных РМЖ (n=20)/ General group of patients with breast cancer (n=20)	52,8 ± 17,4	1,135 (0,735; 2,03)	150,5 (110,5; 221,0) р3=0,0163
Больные РМЖ с метастазами в легкие, до COVID-19 (n=5)/ Breast cancer patients with lung metastases, up to COVID-19 (n=5)	59,6 ± 10,1 р=0,0257	2,6 (0,53; 2,8) р=0,0154	170 (161; 220), N р3=0,0209
Больные РМЖ без метастазов в легкие, до COVID-19 (n=15)/ Breast cancer patients without lung metastases, up to COVID-19 (n=15)	46,5 ± 13,2 р2=0,0546	1,1 (0,75; 1,62)	146 (105; 222) р3=0,0124
Больные РМЖ с бессимптомным течением COVID-19 (n=9)/ Breast cancer patients with asymptomatic COVID-19 (n=9)	51,6 ± 20,7	0,95 (0,72; 1,76), N	146,0 (92; 155) р3=0,0186
Больные РМЖ с COVID-пневмонией (n=11)/ Breast cancer patients with COVID-pneumonia (n=11)	51,1 ± 11,3	1,322 (1,1; 2,8), N	171,5 (145; 222) р3=0,0047
Группа с нормальным содержанием ЭТ-1–21 – до 2,49 пг/мл=1 фМоль/мл (n=16)/ Group with normal ET-1–21 – up to 2.49 pg/ml=1 fMol/ ml (n=16)	50,04 ± 11,9	1,018 (0,66; 1,26), N	146,0 (94; 173) р=0,0076 р3=0,0297
Группа с повышенным содержанием ЭТ-1–21 – выше 2,49 пг/мл, т.е. выше 1 фМоль/мл (n=4)/ Group with an increased content of ET-1–21 – is higher than 2.49 pg/ml, i.e. above 1 fMol/ml (n=4)	58,40 ± 6,5 р=0,0275	2,91 (2,70; 3,35), N р=0,0020; р1=0,0029 р3=0,0066	195,0 (157,5; 348,5) р1=0,0103 р3=0,0209

Примечание: N – нормальное распределение; критический уровень значимости для ЭТ-1–21 и ВМК для групп с нормальным и высоким содержанием ЭТ-1 – р=0,0085, в остальных случаях – р=0,017; значимость различий: р – по сравнению с группой сравнения, р1 – по сравнению с группой с нормальным содержанием ЭТ-1–21, р2 – по сравнению с группой больных РМЖ с метастазами в легкие, р3 – по сравнению с контрольной группой.

Note: N – normal distribution; critical level of significance for ET-1–21 and high molecular weight kininogen for groups with normal and high levels of endothelin-1 – p=0.0085, in other cases – p=0.017; significance of differences: p – compared with the comparison group, p1 – compared with the group with normal ET-1–21, p2 – compared with the group of breast cancer patients with lung metastases, p3 – compared with the control group.

различий). При этом среди больных РМЖ выделяется группа женщин с содержанием ЭТ-1 и ВМК значительно выше уровня у женщин без онкологической патологии и референсного уровня, в которой большинство имели метастазы в легкое и перенесли COVID-пневмонию.

Полученные результаты, прежде всего, подтверждают значительную вовлеченность плазматической системы контактной активации и калликреин-кининовой системы, являющихся частью врожденной системы защиты организма, в патогенез новой коронавирусной инфекции [8–10, 14, 15]. ВМК является сайтом связывания и кофактором активации прекалликреина. В результате ряда протеолитических реакций активируется каскад коагуляции или калликреин-кининовая система с образованием брадикинина, приводя к усилению воспалительных реакций [9]. Было показано, что оболочечные вирусы усиливают активацию внутреннего пути коагуляции крови, образуя комплекс FXII, ВМК и прекалликреина непосредственно на оболочке, как было продемонстрировано, в частности, для вируса простого герпеса HSV1 [27]. S.L. Taylor et al. показано, что при инкубации инфицированных хантавирусом эндотелиальных клеток с компонентами системы контактной активации фактором FXII, прекалликреином и ВМК происходит связывание FXII с клетками и его автоактивация, что приводит к расщеплению ВМК и высвобождению брадикинина [28].

Активность каскада коагуляции и KKS изучалась также при COVID-19, было высказано предположение, что у пациентов, особенно с респираторными осложнениями, может присутствовать нарушение регуляции брадикинин-связанных путей [16]. В исследовании S. Meini et al. установлено, что у пациентов с COVID-19, не находящихся в критическом состоянии, уровни воспалительных биомаркеров (в частности, С-реактивный белок) и биомаркеров свертывания крови (в частности, D-димер, протромбиновое время) значительно различаются, что может свидетельствовать о существовании различных биохимических и клинических фенотипов, в которых могут преобладать провоспалительные или прокоагулянтные реакции. Авторы предполагают, что существует еще не полностью установленная на сегодняшний день связь между изменениями воспалительной и коа-гулянтной систем и клиническими проявлениями COVID-19 [15]. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что уровень ВМК в крови больных РМЖ, перенесших COVID-пневмонию, и уровень ВМК в крови больных РМЖ с бессимптомно протекавшей инфекцией, возможно, отражает разную активность прокоагулянтных или провоспали-тельных процессов. Высказанную S. Meini et al. мысль подтверждает и то, что среди больных РМЖ выделяется группа женщин с содержанием ЭТ-1 и ВМК значительно выше уровня у женщин без онкологической патологии (контрольная группа) и референсного уровня, в которой большинство пациенток (но не все) имели метастазы в легкое, перенесли COVID-пневмонию, а часть не имела сопутствующей патологии. Однако самым неожиданным результатом оказался высокий уровень ВМК в плазме крови у женщин без онкологической патологии после инфицирования коронавирусом, среди которых только у одной инфекция протекала в виде COVID-пневмонии. В связи с полученными результатами необходимо отметить, что интер- претация изменения содержания ВМК у больных РМЖ и у женщин без онкологической патологии не однозначна.