Содержание кремния во фракциях растительного белка

• ²    Federal State Educational Institution ‘People’s Friendship University of Russia’ (RUDN)

117198, Russia, Moscow, Miklukho-Maklaya St, 6

Silicon is biologically important element that is necessary not only for plant, but for all living organisms. Silicon was discovered in all plant organs, where its much quantity accumulates in plan cell walls of leaf and root, giving them a mechanical durability and resistance against abiotic and biotic stresses. Earlier, it was supposed that the silicon was absorbed by plants in form of monosilicic acid and then being deposited as phytoliths or accumulated in epidermal plant cells. Moreover the silicon is not only a basic structural element, but it controls many biological and chemical processes. Water soluble monosilicic acid enters into reaction with metals, organic compounds, showing properties of weak acid. Gels of silicic acid can be a catalyst and a matrix, on which the inner cellular synthesis of organic compounds occurs. In the present study the method to determinate three forms of silicon in plants, such as free, easily hydrolyzed and tightly combined is given. Thus, the part of silicon, 0.5-0.7% was observed in protein preparation of leaves of amaranth. Protein was divided into two fractions, albumins and globulins by precipitation with ammonium sulfate. After that each protein fraction was divided into two by Sephadex, where one of which come out in inner volume of gel, and second one come out in outer volume of gel (G-75). The gel distribution into fractions was of the same type characteristics. The tightly combined silicon was absent in high molecular fraction of albumins and globulins. Most of the silicon was discovered in high molecular fraction of globulins, where 80% of the element was represented by an easily hydrolyzed form. The silicon combined with proteins apparently is in a form of orthosilicic ester of hydroxy-amino acids; however it cannot be excluded that there is the formation of SiN bonds with free amino groups. Biophile silicon is a part of plant silicon (organogenic), which is basically in the form of orthosilicic esters bonded with proteins, phospholipids and pectins that are the plant components being assimilated primarily by human’s organism. In our opinion, this fraction of silicon as a microelement should be taken into account in evaluation of nutritional, forage and pharmaceutical values of plant raw material.

С огласно многочисленным исследованиям, кремний, находящийся в живых тканях в связанном состоянии, выполняет функции, необходимые для нормального роста и развития организма растений, животных и человека [1]. В растительных тканях кремний входит в состав клеточных стенок, образуя комплексы с лигнином, клетчаткой и структурными протеинами [2, 3]. В организме животных и человека кремний также вносит существенный вклад в функционирование соединительных тканей, придаёт прочность стенкам кровеносных сосудов и препятствует проникновению липидов в плазму крови. Кремний способствует биосинтезу коллагена, образованию и кальцификации костных тканей, а в шерсти и рогах животных связывает поперечными мостиками молекулы кера-тина, обеспечивая им прочность и гидрофобные свойства. Кремний участвует в ме-таболизме липидов и фосфора и в поддержании своего равновесия с кальцием, которое связано с процессами старения организма. Введение в пищевой рацион растительного кремния способствует кальцификации и сращиванию повреждённых костных тканей [1].

Работа посвящена изучению фракций кремния, обнаруживаемых в препаратах растительного белка. В работе использованы образцы листьев амаранта ( Amaranthus tricolor , сорт Валентина, листья второго яруса), кипрея ( Epilobium angustifolia ) и капусты брокколи ( Brassica oleracea , суммарный образец из листьев 16-ти ярусов).

Препараты белка извлекали разрушением растительной ткани в гомогенизаторе и экстракцией боратным буфером, с последующим осаждением сульфатом аммония [4], диализом и леофилизацией. Полученные препараты разделяли на фракции по растворимости и с помощью гельфильтрации. Белок растворяли в 0,1 М фосфатном буфере и добавляли сухой сульфат аммония. Фракцию, подобную глобулинам, и осаждаемую при насыщении раствора белка (NH4)2SO4 до 30% концентрации, разделяли далее на две части с помощью сефадекса G-75 (материал внешнего и внутреннего объёма геля). Каждую фракцию упаривали в вакууме, диализовали и подвергали леофилизации.

Фракцию белка, подобную альбуминам, и осаждаемую при насыщении раствора (NH4)2SO4 до концентрации более 50%, диализовали и также разделяли на сефадексе G-75 на две части (как указано выше). В результате для каждого препарата белка было получено 4 фракции, которые подвергали ступенчатому гидролизу для определения содержания в них различных форм кремния.

Препараты белка обрабатывали 2М СF3СООН [5-7], и переводили извлечённый Si в раствор 2 н. H2SO4, в котором устанавливали суммарное количество Si модифицированным методом кремние-вомолибденовой сини с применением рибофлавина в качестве фотосенсибилизатора для восстановления Mo(VI) [8]. Точность определения кремния составила ±0,005% [5]. Объединённые экстракты изоамилового спирта (содержащие кремниевомолибденовую кислоту) упаривали до объёма 5,0 мл и к аликвоте в 2,0 мл добавляли 0,5 мл 5 x10-5 М рибофлавина и 0,5 мл 5x10-3 М Na2-EDTA. Раствор освещали (10 мин) синим светом лампы накаливания через комбинацию светофильтров ЖС-12 и СЗС-22 (освещённость в фокусе конденсора составляла 1,5x105 эргхсм-2хс-1). Облучённый раствор фотометрировали при 750 нм, а калибровочный график строили по стандартным растворам Na2SiO3x9H2O. Холостой опыт на чистоту реактивов проводили точно так же, но без навески белка.

По нашим данным с белком связано более 50% органогенного кремния листьев [5]. Кремний в изученных препаратах неоднороден по прочности связи с органическим веществом. Практически во всех препаратах белка присутствует свободный (легко связанный) «молибдат-активный» кремний, извлекаемый 2 н. H2SO4, а применением различных условий гидролиза (варьирование температуры, крепости кислоты и времени её воздействия) удаётся извлечь разные количества связанного кремния. Поэтому для сравнительных анализов мы предложили определять 3 формы кремния: свободную (экстракция 2 н. Н2SO4), легко гидролизуемую (сумма фракций, извлекаемых 1М СF3СООН за 10 мин. при 100° С, за вычетом свободного кремния) и прочно связанную (остаточный кремний, извле- каемый только 2М СF3СООН за 10 мин. при 120° С). В дальнейшем при оценке количества прочно связанного кремния мы используем разность между его общим содержанием в препарате и суммой свободного и легко гидролизуемого кремния. Полученные данные свидетельствуют о том, что на фракцию легко гидролизуемого Si во всех изученных препаратах белка приходится почти 50% от суммы трёх указанных выше форм кремния.

В листьях амаранта 0,5-0,7% содержащегося в них кремния обнаруживалось в препаратах белка. Доля этого кремния составляла 51,5% ( Amaranthus hypochondriacus ) – 56,5% ( A. tricolor ) от общего количества органогенного Si листьев [5]. При содержании белка в листьях от 15,4 до 19,9% в самом белке может присутствовать до 3,4% Si, причём доля прочносвязанного Si составляет 9-17% от указанной величины. Например, в препарате белка из листьев Amaranthus hypochondriacus при общем содержании кремния 2,7% на-блюда-лось следующее распределение этого элемента по фракциям: 0,77% – свободный, 1,53% – легко гидролизуемый и 0,41% – прочно связанный.

В листьях Amaranthus tricolor (при общем содержании белка 16,7%) в самом препарате белка содержалось 3,2% кремния. Фракция белка, осаждаемая 30% (NH₄)₂SO₄, составила 41,6% от суммарного препарата. В её составе материал, элюируемый во внешнем объёме геля G-75, составил 28,9%, а количество кремния в этой фракции белка достигало 9,0%. Кремний по фракциям распределялся следующим образом. Свободный (1,6%) и легко гидролизуемый (7,4%). Прочно связанный Si в этом препарате отсутствовал. Белок, выходящий во внутреннем объёме геля G-75, составил 71,1%, a Si присутствовал в этом материале в количестве 1,8%. Его распределение по фракциям имело следующий вид. Свободный (0,7%), легко гидролизуемый (0,9%) и прочно связанный (0,2%). Фракция белка, оставшаяся в растворе 30% (NH₄)₂SO₄, составила 59,4% от препарата. В её составе белок, выходящий во внешнем объёме геля G-75, присутствовал в количестве 29,5%, а содержание Si в этой фракции белка составило 3,3%.

Распределение кремния по его фракциям имело следующий характер. Свободный Si – 0,6% и легко гидролизуемый – 2,7%. Прочно связанный Si в препарате отсутствовал. Материал, удерживаемый во внутреннем объёме геля G-75, составил 71,5%, a Si в нём содержался в количестве 2,4%. Все три фракции кремния обнаружены в этой фракции белка: свободный (0,8%), легко гидролизуемый (1,2%) и прочно связанный (0,4%). Распределение кремния по фракциям белка в листьях капусты брокколи и кипрея представлено в таблице.

Для всех трёх изученных видов растений общий характер распределения кремния во фракциях белка оказался однотипным. В высокомолекулярных фракциях «альбуминов» и «глобулинов» прочно связанный кремний отсутствовал. Наибольшее количество Si обнаружено в высоко молекулярной фракции «глобулинов», причём на 80% этот элемент был представлен его легко гидролизуемой фракцией.

Связанный в белках Si, по-видимому, представлен ортокремниевыми эфирами оксиаминокислот, однако, нельзя исключать и образование Si-N связей со свободными аминогруппами. У бобовых, например, у Trifolium pratense , с общим белком связано в 4 раза меньше кремния (0,14% на сухую массу листа), хотя содержание белка лежит в тех же пределах, что и в листьях амарантов.

Отсюда следует, что листья амарантов одновременно богаты и белком, и кремнием, причём именно той формой кремния, которую мы предложили называть «биофильной» [9, 10].

Биофильный кремний – это та часть растительного (органогенного) кремния, которая химически (в основном в форме ортокремниевых эфиров) связана с белком, фосфолипидами и пектинами, то есть с теми компонентами растительной ткани, которые в первую очередь усваиваются организмом человека. Эту фракцию кремния (как микроэлемент) по нашему мнению необходимо учитывать в числе показателей, определяющих пищевую, кормовую и фармацевтическую ценность растительного сырья.

Содержание кремния во фракциях белка из листьев некоторых растений (% на абсолютно сухую массу)