Содержание пигментов в растениях Lepidium sativum в условиях хлоридно-натриевого засоления и ощелачивания

Введение                                  фотоокислительного стресса и защищают клетки

Неблагоприятные условия среды, такие как низкие температуры, засуха, засоление и др., оказывают существенное влияние на фотосинтетический аппарат растений. Фотосинтез и дыхание являются процессами, которые обеспечивают материально-энергетическую основу жизнедеятельности растений. Они поставляют необходимые для роста и поддержания растительных клеток АТФ, НАД(Ф)Н и метаболиты.

Высокий уровень засоления отрицательно действует на структурно-функциональное состояние хлоропластов, процесс циклического фосфорилирования, на реакционные центры фотосистемы [Структура …, 1970; Белецкий, Шевякова, Карнаухова, 1990].

Стрессовые факторы, в том числе засоление, существенно повышают вероятность развития фотоо-кислительных повреждений. В клетках растений образование активных форм кислорода наиболее интенсивно идет в хлоропластах. В составе липидов мембран хлоропластов содержится большое количество ненасыщенных жирных кислот, значительная часть супероксидных анионов возникает при функционировании электрон-транспортной цепи фотосинтеза, образование кислородных радикалов происходит при фотоокислении воды [Перекисное ..., 1997].

В тушении избыточной энергии триплетных состояний хлорофилла и синглетного кислорода важная роль принадлежит каротиноидам. Являясь антиоксидантами, каротиноиды уменьшают последствия растений от повреждений [Чиркова, 2002; Половни-кова, Воскресенская, 2008; Bolwell, 1999; Mittler, 2002; Foyer, Shigeoka, 2011].

Повышение устойчивости растений к засолению и другим неблагоприятным факторам среды связано со значительными перестройками физиолого-биохимических процессов и с изменением экспрессии довольно большого количества генов [Сигнальная роль ..., 2012].

В настоящее время обсуждается возможность существования комплексной устойчивости, которая обусловлена реакцией различных метаболических систем. В ответ на действие определенного стрессора устойчивость клеток повышается не только к нему, но и к другим повреждающим факторам. Литературные данные свидетельствуют о функционировании одних и тех же систем устойчивости к двум или нескольким факторам различной природы [Hale, 1969; Общие системы ..., 1990; Стрессорный ответ ..., 1994; Маевская, Николаева, 2013]. Эти механизмы направлены на экономию энергетических и структурных ресурсов растительных организмов в стрессовых условиях.

Участие пигментного аппарата в устойчивости и адаптации растений к комбинированному действию засоления и ощелачивания является недостаточно исследованным. В связи с этим целью нашей работы было изучение раздельного и комбинированного действия засоления и ощелачивания на ростовые

процессы и содержание фотосинтетических пигментов в растениях кресс-салата.

Объект и методы исследования

В качестве тест-культуры были взяты растения кресс-салата ( Lepidium sativum L., Brassicaceae ), достигшие состояния технической спелости. Поставлены модельные опыты, субстратом являлся вермикулит. Для ощелачивания корневой среды (рН = 8, 9, 10) использовали раствор гидроксида натрия, для засоления – 0.5%-ный раствор хлорида натрия. Кресс-салат выращивался в сосудах на среде Кнопа, pH раствора контролировали при помощи pH-метра. Исследовали раздельное и комбинированное действие засоления и ощелачивания. В качестве контроля служили растения, выращенные на среде Кнопа с рН = 7.

Показатели роста и сырой биомассы определяли путем измерения надземной части 25 растений и их взвешивания на аналитических весах.

Количество пигментов определяли спектрофотометрическим методом при длинах волн 665, 649 и 440 нм. Для расчета концентрации хлорофиллов а , б и каротиноидов использовали формулы Винтер-манса де Мотса [Гавриленко, Жигалова, 2003]. Повторность опытов трехкратная. Полученные данные статистически обработаны с помощью компьютерной программы Stadia. Показатель достоверности различий между опытными вариантами и контрольным был установлен с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Определяли корреляционные зависимости между содержанием пигментов, высотой и массой растений.

Результаты и их обсуждение

Рост как интегральный процесс является одним из важных показателей адаптации растений к условиям обитания. Он является сложной функцией многих физиолого-биохимических процессов.

Изучение раздельного влияния изучаемых факторов показало, что в вариантах с рН корнеобитаемой среды, равной 8 и 9, масса растений и их вы- сота не уступали контролю или даже чуть превы-

Рис. 1 . Влияние ощелачивания и засоления на высоту надземной части кресс-салата, см

Вероятно, это связано с тем, что корневая система растений способна смещать рН окружающей их питательной среды и создавать в зоне, непосредственно прилегающей к корням, благоприятные условия рН. Таким образом, находясь в зависимости от среды, растения способны в известной степени сами воздействовать на величину рН, как бы приспосабливая среду к своим потребностям. Регулирование рН достигается путем различного поглощения растением из питательной среды анионов и катионов [Якушкина, Бахтенко, 2005].

Рис. 2. Влияние ощелачивания и засоления на массу растений, г

Проведенный однофакторный дисперсионный анализ свидетельствует о том, что действие засоления (0.5% NaCl) достоверно ингибировало рост и массу кресс-салата по отношению к контролю. Отдельное действие высокого уровня ощелачивания (рН = 10) повлияло на высоту растений.

В природных условиях растения кресс-салата произрастают в условиях засушливых и полузасу-шливых районов, где им приходится переживать периоды дефицита воды. У кресс-салата отсутствуют эволюционно сложившиеся механизмы соле-устойчивости. Адаптация таких растений может идти за счет включения эффективных механизмов засухоустойчивости, к которым относится способность к осморегуляции, стабильность водного и осмотического потенциалов содержимого клеток растений [Hare, Gress, Van Stader, 1998; Patakas, Noitsakis, 2000].

Ингибирующего влияния ощелачивания на фоне засоления корневой среды не установлено, даже при рН = 10, вероятно, при комбинировании факторов имеет место кросс-адаптация – повышение устойчивости за счет неспецифических внутриклеточных процессов.

Как видно из данных табл. 1, наблюдается сильная прямая корреляция (r = 0.94) между высотой растений и их массой. Неблагоприятное действие засоления на рост и массу растений связано как со снижением доступности воды, так и с токсическим действием ионов натрия и хлора на клетки растений [Захарин, Паничкин, 2009]. Под влиянием засоляющих ионов происходит торможение синтеза белков и нуклеиновых кислот, что влечет за собой снижение ростовых процессов и сокращение темпов нарастания биомассы. Торможение роста ли- стьев является защитной реакцией на дефицит воды за счет снижения транспирации [Lu, воды, так как уменьшение площади листовой по- Neumann, 1998; Иванов, 2010].

верхности позволяет растениям сократить потери

Таблица 1

Коэффициенты корреляции между изучаемыми показателями

Показатели	Высота, см	Масса, г	Хлорофилл а , мг/г	Хлорофилл в , мг/г	Хлорофиллы а + в , мг/г	Каротиноиды, мг/г
Высота, см	1.00	0.94	–0.81	–0.69*	–0.81	–0.65*
Масса, г	0.94	1.00	–0.71	–0.74	–0.77	–0.48*
Хлорофилл а , мг/г	–0.81	–0.71	1.00	0.69*	0.95	0.91
Хлорофилл в , мг/г	–0.69*	–0.74	0.69*	1.00	0.86	0.37*
Хлорофиллы а + в , мг/г	–0.81	–0.77	0.95	0.86	1.00	0.74
Каротиноиды, мг/г	–0.65*	–0.48*	0.91	0.37*	0.74	1.00

Примечание. Данные статистически достоверны при 0.95%-ном уровне значимости, за исключением помеченных *.

При стрессовых воздействиях, таких как засуха, засоление, действие низких температур и др., большое значение принадлежит гормональной системе регуляции. Снижение уровня гормонов-сти-муляторов, таких как индолилуксусная кислота (ИУК), гиббереллины и накопление ингибиторов роста – абсцизовой кислоты (АБК) и этилена, которые называют стрессовыми гормонами, имеет адаптивное значение, поскольку приводит к снижению интенсивности обмена веществ, торможению процессов клеточного деления и растяжения [Чиркова, 2002]. Абсцизовая кислота ингибирует деятельность Н+-АТФаз, что ведет к снижению рН цитоплазмы и усилению гидролитических процессов.

В условиях солевого стресса поддержание ионного и водного гомеостаза клеток осуществляется с помощью протонных насосов плазма-леммы и тонопласта. В результате их работы на мембранах плазмалеммы и тонопласта генерируется электрохимический потенциал протонов ∆µН+, от которого зависит не только вторично-активный, но и пассивный транспорт ионов, в том числе Na+и Cl- [Палладина, 1991].

ИУК способна усиливать функционирование протонного насоса плазмалеммы путем изменения содержания в мембранах ферментативных белков, а также их молекулярной активности. Высказывается мнение, что ИУК, также как и АБК, играет в растениях роль «стрессового сигнала» при засолении [Сигнальная роль ..., 2012].

Исследование состояния пигментного аппарата имеет важное значение для понимания механизмов адаптации растительных организмов к действию стрессовых факторов. Хлорофиллы а и б являются основными фотосинтетически деятельными компонентами листьев растений. Содержание и соотношение разных форм пигментов в хлоропластах может служить одним из показателей их фотохимической активности. Поддержание структуры и функции мембран хлоропластов в стабильном состоянии при действии неблагоприятных факторов среды обеспечивает более скоординированную работу компонентов электрон-транспортной цепи [Влияние гена ..., 2011].

Литературные данные о влиянии засоления на уровень хлорофиллов в листьях растений противоречивы. Одни авторы [Структура ..., 1970; Га-рифзянов, Горелова, 2006] приводят данные о снижении количества этих пигментов при засолении, другие [Шахов, 1956; Удовенко, Семухина, Петроченко, 1971; Кусакина, Еремченко, Четина, 2013] отмечают их повышение или отсутствие существенных изменений.

Результаты определения содержания зеленых пигментов свидетельствуют о том, что в вариантах с увеличением степени ощелачивания корневой среды количество хлорофиллов а и б было достоверно выше по сравнению с контрольным вариантом (табл. 2).

Таблица 2

Влияние ощелачивания и засоления на содержание пигментов в растениях кресс-салата, мг/г сырой массы

Вариант	Хлорофилл а	Хлорофилл в	Хлорофиллы а + в	Каротиноиды
Контроль	2.44±0.15	0.64±0.03	3.08±0.17	0.88±0.05
pH 8	2.78±0.06	0.78±0.04	3.55±0.11	1.02±0.02
pH 9	2.89±0.10	0.80±0.05	3.69±0.15	1.05±0.04
pH 10	3.08±0.22	0.90±0.05	3.98±0.27	1.12±0.09
0.5 % NaCl	3.24±0.11	0.83±0.03	4.07±0.13	1.17±0.06
0.5 % NaCl + pH 8	3.08±0.17	1.42±0.11	4.49±0.28	1.02±0.05
0.5 % NaCl + pH 9	3.43±0.13	1.44±0.05	4.87±0.18	1.12±0.05
0.5 % NaCl + pH 10	3.52±0.12	1.13± 0.28	4.98±0.19	1.18±0.04

В большей степени это проявилось в отношении такого фотосинтетического пигмента, как хлорофилл а . Увеличение биосинтеза хлорофилла а , вероятно, является одной из приспособительных реакций кресс-салата к действию засоления и ощелачивания корневой среды.

Комбинированное действие ощелачивания и засоления способствовало более значительному повышению содержания хлорофиллов а и б , а также их суммы в сравнении с контролем и раздельным влиянием данных изучаемых факторов. Это явление можно рассматривать как кросс-адаптацию, когда растения, адаптируясь к действию одного фактора, приобретают устойчивость к другому. Сопряженное повышение устойчивости к обезвоживанию и перегреву, тепловому стрессу и засолению [Общие системы ..., 1990].

Сопоставляя полученные данные с ростовыми параметрами, можно отметить, что повышение содержания пигментов коррелировало со снижением роста культуры. Из табл. 1 видно, что между высотой, массой и содержанием хлорофиллов а установлена сильная обратная корреляция (r = –0.81 и r = –0.71 соответственно). Накопление пигментов может быть следствием торможения ростовых процессов под влиянием токсического действия солей при продолжающемся биосинтезе пигментов [Удовенко, 1977]. Повышение количества этих соединений является активной реакцией растений в противовес неблагоприятному действию засоляющих ионов.

Представляет интерес отношение содержания хлорофиллов а и б . Хлорофилл а является компонентом как коровых комплексов, так и периферической антенны фотосистемы I (ФС I) и фотосистемы II (ФС II), тогда как хлорофилл б является компонентом периферической антенны обеих фотосистем. Он входит преимущественно в белковый светособирающий комплекс ФСII, так называемый ССК II [Бухов, Бондарь, Дроздова, 1998; Vermaas, 1993]. Поэтому изменение отношения хлорофиллов а / в может рассматриваться как нарушение в стехиометрии между комплексами реакционных центров фотосистем и ССК II [Бухов, Бондарь, Дроздова, 1998; Дымова, Головко, 2007].

Результаты опытов показали, что как отдельное действие засоления, так и ощелачивания, существенно не отразились на величине отношения хлорофилла а к хлорофиллу б . Отсутствие значительных изменений в величине этого показателя позволяет предположить, что эти факторы не оказывают влияния на светособирающий комплекс тилакоидных мембран данной тест-культуры (рис. 3).

При совместном действии засоления и ощелачивания происходило снижение этого показателя в листьях кресс-салата по сравнению с контролем, что, вероятно, может свидетельствовать о повышении доли хлорофиллов, принадлежащих ССК II.

Одной их функций ССК II является стабилизация мембраной структуры хлоропластов [Бухов, Бондарь, Дроздова, 1998].

Высокие концентрации хлорида натрия вызывают усиление генерации активных форм кислорода (АФК). Они могут образовываться в электрон-транспортной цепи хлоропластов и митохондрий. Окислительный стресс может вызывать перекисное окисление липидов, инактивацию белков и ферментов, нарушение целостности мембран и деградацию хлорофилла [Кения, Лукаш, Гуськов,

Рис. 3 . Влияние засоления и ощелачивания на отношение хлорофилла а к хлорофиллу в

При адаптации растений к действию неблагоприятных факторов среды важное значение имеют такие соединения, как каротиноиды, что связано с их антиоксидантными свойствами [Чиркова, 2002; Mittler, 2002]. Каротиноиды являются обязательными компонентами фотосинтетического аппарата растений. Это полиеновые соединения, имеющие систему сопряженных связей. Они играют роль вспомогательных светособирающих комплексов в той части солнечного спектра, в которой слабо поглощает хлорофилл, выполняют фотопротектор-ную, структурную и защитную функции, а также принимают участие в фотохимических процессах ФС Iи ФС II [Merzlyak, Solovchenko, 2002; Содержание ликопина ..., 2009].

Было установлено, что действие ощелачивания корневой среды, особенно в сочетании с засоляющим фактором, достоверно повысило количество каротиноидов в растениях кресс-салата по сравнению с контрольным вариантом (табл. 2). Повышение содержания этих соединений имеет адаптивное значение, т. к. каротиноидам принадлежит протекторная роль. Они являются компонентами антиоксидантной системы, в функции которой входит защита мембран от повреждающего действия свободных радикалов [Чиркова, 2002; Дымова, Головко, 2007].

Каротиноиды могут также защищать растения от окислительного стресса, изменяя физические свойства фотосинтетических мембран при участии ксантофилового цикла [Кузнецов, Дмитриева, 2005]. Они способны переводить триплетный хлорофилл и синглетный кислород в основное состояние за счет образования триплетного каротиноида, который диссипирует энергию в тепло, препят- ствуя, таким образом, развитию окислительных процессов [Чиркова, 2002].

Из данных табл. 1 видно, что имеется средняя обратная корреляция между высотой (r = –0.65) и массой растений (r = –0.48) с содержанием в них каротиноидов. Более сильная прямая корреляция (r = 0.91) установлена между содержанием каротиноидов и хлорофилла а по сравнению с хлорофиллом в (r = 0.37). Высокая корреляция (r = 0.74) обнаружена между суммарным количеством хлорофиллов и содержанием каротиноидов в растениях кресс-салата ( см. табл. 1).

Учитывая особую роль вспомогательных пигментов фотосинтеза в устойчивости хлорофиллов к фотоокислению, увеличение пула каротиноидов можно рассматривать как один из факторов, обеспечивающих резистентность растений кресс-салата к действию засоляющих ионов и ощелачивания. Повышение уровня каротиноидов указывает на активное функционирование адаптивных механизмов в фотосинтетическом аппарате растений при действии неблагоприятных условий среды.

Выводы

• 1.    Засоление корневой среды (0.5%-ный NaCl) оказало ингибирующее влияние на высоту и массу кресс-салата.

• 2.    Повышение уровня содержания хлорофиллов а и б при комбинированном действии засоления и ощелачивания, по-видимому, является одной из адаптивных реакций кресс-салата, обеспечивающих резистентность к действию данных неблагоприятных факторов.

• 3.    При комбинированном действии засоления и ощелачивания корневой среды более значительно возрастало количество хлорофилла б , соотношение между хлорофиллами заметно снижалось.

• 4.    Увеличение пула каротиноидов при отдельном и совместном действии засоления и ощелачивания свидетельствует об активации защитных механизмов антиоксидантной системы растений.