Содержание продуктов перекисного окисления липидов и антиоксидантных ферментов в плазме крови сукрольных и лактирующих самок кролика

Б нормальных условиях процессы перекисного окисления липццов (ПОЛ) находятся на невысоком уровне, но при стрессовых ситуациях происходит некоторое усиление образования АФК что в конечном итоге может привести к патологическому' состоянию, которое сопровождается дисбалансом ферментативных и не ферментативных компонентов системы ан-тиокевдантной защиты [Владимиров, 1998J. Физиологическая беременность и лактация как фактор изменения внутренней среды может сопровождаться существенными изменениями в про/антиоксидантном статусе [Гусак Лазарева. Морозов, 2006J.

Характерным проявлением окислительного стресса является интенсификация процессов ПОЛ. идентификатором которых служит увеличение содержания хотя бы одного продукта, образовавше гося в результате окислительных процессов. Данные о содержании продуктов ПОЛ в биологических объектах могут нести в себе информацию о глубине и степени патологического процесса. В качестве количественных маркеров для ПОЛ являются; диеновые конъюгаты и малоновый диальдегид* Изменения антиоксидантной защиты наблюдали за счет изменения реакции ферментов каталазы и супероксиддисмутазы (СОД).

Период беременности у крольчих - 30-34 дня. Внутриутробное развитие плодов происходит очень быстро: через 10-12 ч. после оплодотворения яйцеклетки начинают делиться; на 4-й день бластулы имеют 0.3 мм в диаметре, на 8-й - прикрепляются к стенке матки, на 13-й - их можно прощупать через брюшную стенку* на 16-й - плоды начинают двигаться, к 30-му дню (моменту рождения) вес каждого крольчонка составляет от 40

(С Тарасов С С., Корягин А. С., 2016

до 90 г, в зависимости от их количества, породы кроликов и условий кормления матери. Самки рождают по 6—12t иногда по 16-19 крольчат в помете. [Harcourt-Brown, 2002].

Период лактации у крольчих, при содержании с ними крольчат, продолжается более двух месяцев. При этом количество выделяемого молока до 20-го дня увеличивается, а затем уменьшается, особенно резко после 30-го дня. Крольчиха во время лактации ежедневно дает от 50 до 270 г молока, чаще 100-200 г [Flecknell, 2002; Седов, 2009; Ульихина, 2009].

Отделение молока начинается незадолго до окрола. Примерно до 20-го дня молочность крольчих постепенно увеличивается, с 21-го до 25-го дня количество выделяемого молока остается неизменным. а затем постепенно снижается.

Иногда выделение молока у крольчих не прекращается и через 60 дней после окрола, что позволяет использовать их в качестве кормилиц других крольчат после отсадки своих.

Материалы и методы

Исследования проводили на вторично сукроль-ных кроликах породы «Советская шиншилла» в возрасте 10-12 месяцев. Животных содержали на экспериментальной ферме компании «ВитАс». кормили комбикормами-концентратами и сухим грубым кормом (сено). поили водой, еда и вода были у животных всегда, т е. Они потребляли пищи по потребности. В эксперименте было задействовано 9 самок, по три в каждой группе.

Забор крови проводили из ушной вены на 1. 3. 7, 14, 21-й день у беременных самок и в день окрола. В случае изучения лактации через 1. 3. 7. 14 и 21 день, а при изучении индуктивного влияния лактации и сукрольности на процессы ПОЛ через 1, 2. 3, 7. 14. 21 день и в день окрола.

Определение содержания диеновых конъюгатов в плазме крови проводили путём добавления к 0.2 мл плазмы 2 мл смеси изопропанол/гептан (1:1). Смесь встряхивали в течение 1-го ч.. после чего добавляли 0.5 мл НС1 (pH = 2) и ещё раз встряхивали 2 мин., затем добавляли I мл гептана и встряхивали ещё 15 мин., после истечения 1-го часа верхнюю фазу фотометрировали при 232 нм против контрольной пробы [Стальная, ГарИШВИЛИ. 1977].

Определение содержания малонового диальдегида проводили методом, основанным на взаимодействии его с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТЕК), в результате которого образуются хромогены с максимум поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм [Стальная. Га-ришвили. 1977],

Активность СОД определяли по методике ЕЕ. Дубиноной. Л.А. Салтыковой, Л.Ф. Ефимовой

[1983]. Метод основан на способности СОД конкурировать с нитросиним тетрозолем за супеоксид-ные анион-радикалы, образующие в результате аэробного взаимодействия НАДН с феназинметасульфатом. В присутствии СОД процент восстановления НС1 уменьшается [Дубинина, Сальникова, Ефимова, 1983].

Активность каталазы определяли по методу; основанному на способности данного фермента разлагать перекись водорода с образованием воды. Активность определяется по снижению количества пероксида в пробе, определяемого по уменьшению экстинкции пробы [Patterson et al.. 1984].

Результаты и их обсуждение

Выявлено, что в первые 3 дня после спаривания увеличивается концентрация диеновых конъюгатов примерно на 40%, то же самое наблюдается и с малоновым диальдегидом. На 7-й день беременности наблюдается снижение концентрации ДК примерно на 25% и МДА - на 15%. Незначительное снижение зафиксировано и в последующие дни беременности (рис. 1), Это можно объяснить тем. что сразу же после зачатия происходит значительная перестройка жизнедеятельности организма беременных самок, которая сопряжена с изменениями в системах крови, гемостаза, эндокринной, иммунной системах и с изменением биохимического состояния организма в целом. «Не ожидая» подобных изменений, ткани и органы испытывают определенный стресс, в результате которого резко повышается количество свободных радикалов, атакующих, помимо прочего, клетки плаценты и эмбриона. Резкий спад, после 3-го дня беременности, концентрации продуктов ПОЛ, возможно, связан с короткими сроками беременности кроликов [Седов. 2009], а также с их быстрыми адаптационными процессами.

Рис. L Содержание продуктов ПОЛ в плазме крови самок кролика на разных стадиях беременности:

ДК - диеновые конъюгаты, МД - малоновый диальдегид

В день окрола наблюдается резкое увеличение продуктов ПОЛ, почти на 100% по отношению к контролю. Данное явление можно также объяснить серьезными биохимическими изменениями, возникшими в результате стрессового состояния, выбросом адреналина, кортизола и прогестерона в кровь животного [Савченко и др„ 2006].

Анализируя концентрации продуктов ПОЛ в плазме крови лактирующих самок, можно сказать, что в 1-й день лактации (день окрола) наблюдается резкое повышение уровня ПОЛ, но уже на 3-й день лактации заметно статистически значимое снижение диеновых конъюгатов, примерно на 40%. а малонового диальдегида примерно на 10% (рис. 2). К 7-му дню лактации наблюдается незначительное понижение продуктов ПОЛ, а на 14-й день их концентрация приближается к уровню контроля, таким образом, выходит на нормальный уровень. Это можно объяснить тем, что после стрессового состояния организм самок постепенно начинает приходить в норму, а также тем, что процессы лактогенеза сопровождаются повышенным выделением антиоксидантных ферментов (см. рис. 4).

Рис. 2, Содержание продуктов ПОЛ в плазме крови кролика на разных стадиях лактации самки.

Обозначения см, рис, I

Интересной особенностью кроликов является их способность одновременно вынашивать и выкармливать молодняк [Ульихина, 2009]. Однозначно такое «мероприятие» является сильной нагрузкой на организм животного и может иметь биологический смысл лишь при благоприятных условиях существования. Соответственно при таком явлении меняются и процессы ПОЛ. Зафиксировано. что у животных при спаривании в день окрола концентрация продуктов ПОЛ высокая, как упоминалось выше; после трех дней сукрольности и лактации наблюдается ещё большее увеличение продуктов ПОЛ, однако увеличение незначительное. в районе 10%. Через неделю зафиксирован спад концентрации МДА и ДК примерно на 30% относительно предыдущего измерения. На 14-й день происходит резкое снижение концентрации продуктов ПОЛ по отношению к 7-дневному измерению около 80% и становится даже ниже на 10% относительно контроля (Р<0.05). В последующие измерения статистически значимых изменений не наблюдалось (Р>0.05), а концентрация МДА и ДК в день окрола оставалась на уровне контроля (рис. 3). Данное состояние процессов ПОЛ можно объяснить тем, что в первые дни организм животного испытывает огромные нагрузки и не способен на защиту от атаки свободных радикалов, однако такое состояние приводит к «боевой» готовности организм самок и при благоприятных условиях вырабатывает большое количество веществ, подавляющих процессы ПОЛ, что в итоге приводит к «легкому» окролу.

К 1д Зд 7д 14д    21д окрол

Срок беременности + время лактации

Рис. 3, Содержание продуктов ПОЛ в плазме крови кролика на разных стадиях беременных и одновременно лактирующих самок

Обозначения см. рис. 1

Для более полной картины влияния беременности и лактации на процессы ПОЛ исследовали содержание антиоксидантных ферментов в плазме крови. У беременных самок наблюдается в первую неделю существенный рост СОД (рис. 4) по отношению к контролю более чем в 2 раза (Р<0.05). На 14-е сутки зафиксировано падение концентрации фермента на 20% по отношению к предыдущему измерению, на 21-е сутки и в день окрола концентрация СОД становится равной концентрации контрольных проб. Каталаза в крови обнаружена в небольших количествах [Stocker, Frei, 1991], максимальные значения зафиксированы на уровнях 7 и 14 дней беременности. Рост ферментативной активности, возможно, объясняется тем, что в первые дни беременности организм испытывает повышенный стресс и в его условиях увеличивается количество свободно-радикальных соединений, которые необходимо утилизировать антиоксидантами.

У лактирующих самок наблюдается увеличение активности СОД с 1-го ио 14-й день, на 21-й день зафиксирован спад активности СОД на 25% по отношению к предыдущему измерению (рис. 5), однако он оставался выше контроля на 30% (Р<0.05).

Скорость активности каталазы статистически значимо не изменялась. Рост СОД в первые 14 дней лактации можно объяснить тем, что во время беременности происходит повышение процессов ПОЛ (см. рис. 1), а, следовательно, для нормализации необходимы вещества, препятствующие образованию свободных радикалов, каким и является

Рис. 4, Активность антиоксидантных ферментов в плазме крови на разных стадиях беременности самки кролика: СОД - супсроксиддисмутаза, кат - каталаза

Рис. 5» Активность антиоксидантных ферментов в плазме крови на разных стадиях у л актирующих самок кролика.

Обозначения см. рис. 4

Животные, которые одновременно вынашивали и выкармливали крольчат, имеют схожую картину7 активности СОД с просто л актирующими самками (рис. 6). Но отличаются более резким ростом концентрации СОД в первые 7 дней почти на 150% по отношению к контролю, а также резким падением на 14-й день по отношению к предыдущему измерению с последующим снижением на 30% к 14-му дню и к моменту7 окрола. Стоит отметить, что в данной группе животных наблюдается рост каталазы на 7-. 14- и 21-й день примерно на 35% по отношению как к контролю, так и ко всем остальным измерениям; данный процесс, возможно, связан с тем, что повышенное содержание свободных радикалов вызвало гиперэкспрессию генов катала зы, которая привела к повышению ее концентрации и как следствие ее активности.

Срок беременности ♦ время лактации

Рис. 6, Активность антиоксидантных ферментов в плазме крови на разных стадиях у беременных и одновременно л актирующих самок кролика.

Обозначения см. рис. 4

Выводы

• 1.    Содержание продуктов перекисного окисления липидов у беременных самок увеличивается в течение первых трех дней беременности, с последующим понижением и резко возрастает в день окрола.

• 2.    Активность су пероксидд нему тазы у беременных самок увеличивается в первые 7 дней с последующим уменьшением, изменение активности каталазы незначительно.

• 3.    Уровень продуктов перекисного окисления липидов у лактирующих самок снижается с момента окрола на протяжении всего исследуемого периода лактации, концентрация супероксиддис-мутазы увеличивается в первые 7 дней с последующим понижением, каталаза изменений не показала.

• 4.    У животных, одновременно беременных и лактирующих. зафиксировано резкое увеличение как малонового диальдегида, так и диеновых конъюгатов в первые 3 дня, с последующим снижением. в период окрола концентрация этих веществ не превышала контроль.

• 5.    Активность су пероксидд нему тазы у беременных и лактирующих самок резко увеличивалась в первые 3 дня. с последующим резким падением, более 100% на 14-й день и падением на 30% к 14-му дню и дню окрола, также зафиксирована активность каталазы на 7-, 14- и 21-й день.