Сократительная активность и энергетический метаболизм постинфарктного сердца на фоне диабетического поражения в эксперименте

Как известно, сочетание ишемической болезни сердца и сахарного диабета повышает вероятность сосудистых катастроф. Развитие сократительных дисфункций при диабетическом поражении миокарда связано как с ремоделированием клеточных мембран кардиомиоцитов [1], так и с нарушением энергетического метаболизма. Снижение содержания и доступности АТФ для метаболических процессов служит дополнительным фактором дисбаланса гомеостаза Са2+ в кардиомиоцитах. Одной из ключевых энергозависимых структур кардиомиоцитов, отвечающих за внутриклеточный гомеостаз Са2+, и соответственно, за инотропный ответ клетки, является сар- коплазматический ретикулум (СР). Показано, что нарушение функций этой внутриклеточной структуры при сердечной недостаточности сопровождается инверсией ритмоинотропных реакций миокарда [2, 3]. Причиной этого является зависимость функционального состояния СР, в частности, активности его Са2+-транспортирующих систем от энергетической обеспеченности отдельных кардиомиоцитов [4]. Вместе с тем механизмы развития инотропных нарушений, связанных с ремоделированни-ем кальций-транспортируюших систем, а также состояние окислительного фосфорилирования кардиомиоцитов при сердечной недостаточности на фоне сахарного диабета недостаточно изучены.

Цель исследования: оценить сократительную активность и энергетический метаболизм постинфарктного сердца на фоне диабетического поражения.

Материал и методы

Работа выполнена на 45 половозрелых крысах-самцах линии Вистар. Животных разделили на 4 группы: I группу составили интактные животные (n=12), II группу – крысы с постинфарктным кардиосклерозом (ПИКС), (n=11), III группу – животные с индуцированным сахарным диабетом (n=8), и IV группу – крысы, которым через 2 недели после коронароокклюзии моделировали диабет (n=8). Инфаркт миокарда моделировали путем окклюзии левой нисходящей коронарной артерии [2]. Сахарный диабет моделировали однократным введением стрептозотоцина (Sigma, США) в дозе 60 мг/кг, внутрибрюшинно, разведенного в 0,01 моль/л цитратном буфере (рН 4,5) [5, 6]. Крыс IV группы брали в эксперимент через 4 недели после индукции диабета. Концентрацию глюкозы в сыворотке крови определяли ферментно-ко-лорометрическим тестом (Biocon Diagnostic, Германия). В сердцах крыс II и IV групп оценивали размер постинфарктных рубцов методом планиметрии [7].

В день эксперимента животных, находящихся под легким эфирным наркозом, обездвиживали смещением шейного отдела позвоночника. Извлекали сердце из грудной полости и промывали его в проточной камере через аорту раствором Кребса–Хензеляйта следующего состава (в мМ): NaCl – 120; KCl – 4,8; CaCl2 – 2,0; MgSO4 – 1,2; KH2PO4 – 1,2; NaHCO3 – 20,0; глюкоза – 10,0 (Sigma, США). Выделенные папиллярные мышцы помещали в термостабилизированную проточную камеру. Один конец мышцы фиксировали к стенке камеры, а второй – закрепляли на штоке изометрического датчика (6МХ1С). Перфузию мышц осуществляли при 36,5 °С оксигенированным (О2 – 95%, СО2– 5%) раствором Кребса–Хензеляйта. Стимуляцию мышц проводили электрическими импульсами прямоугольной формы длительностью 5 мс при частоте 0,5 Гц. Регистрировали кривые изометрического сокращения папиллярных мышц. Экстрасистолическое воздей- ствие оказывали при помощи однократного нанесения внеочередного электрического импульса через 0,2–1,5 с от начала регулярного цикла [2]. Измеряли амплитуду эк-страсистолического (ЭС) и постэкстрасистолического (ПЭС) сокращения и выражали ее в процентах к амплитуде регулярного цикла.

Митохондрии сердца получали методом дифференциального центрифугирования в стандартной сахарозной среде, содержащей (мМ) 300 сахарозу, 10 ЭДТА, 8 трис, рН 7.4. Митохондрии суспендировали в 250 мМ растворе сахарозы. Скорость поглощения кислорода митохондриями определяли полярографически с помощью электрода Кларка. Измерение проводили в среде, содержащей (мМ) 300 сахарозу, 10 КСl, 5 КН2РО4, 5 сукцинат (или 5 малат + 5 глутамат), 1 ЭДТА, 5 трис, рН 7.4. Измерения проводили в термостатируемой ячейке объемом 1 мл при температуре 27 °С и постоянном перемешивании при помощи магнитной мешалки. Регистрировали скорость поглощения кислорода без АДФ и в присутствии 100 мкМ АДФ. Ингибирование фосфолипазы А2 проводили при помощи бром-фенацилбромида Реакцию начинали добавлением суспензии митохондрий (2 мг белка). Концентрацию белка в пробе определяли методом Лоури. В работе использовали реактивы фирм Sigma и ICN. Скорость потребления кислорода приведена в нМ О2 в мин на 1 мг белка.

Полученные данные обработаны общепринятыми методами вариационной статистики, представлены как M± σ , статистическую значимость различий показателей оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и U Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования показали, что ремоделирование миокарда после коронароокклюзии во II группе сопровождалось снижением массы тела на 18,8% и гипертрофией сердца на 90% по сравнению с I группой (табл. 1). Индукция диабета через 4 недели в III группе вызывала снижение массы тела на 56% (р<0,01), тогда как в IV группе отмечалось снижение массы тела только на 26%. Повышение концентрации глюкозы в крови наблюдалось в III и IV группах, что свидетельствует о развитии сахарного диабета в этих группах.

Исследование инотропной реакции на ЭС воздействия показало, что амплитуда ЭС сокращения миокарда животных II группы после ЭС интервала длительностью 0,25 с была выше на 8% (р<0,01) по сравнению с I группой, при этом с увеличением длительности ЭС интервала эта разница увеличивалась и достигала 16% (р<0,01), рисунок 1.

Повышение амплитуды ЭС сокращений во II группе свидетельствует об увеличении внутриклеточного содержания ионов кальция, участвующих в ЭС сокращении. Как известно, ишемическое поражение сердца характеризуется угнетением синтеза АТФ, что приводит к нарушению работы АТФ–зависимых ионных насосов и, соответственно, к повышению внутриклеточной концентрации Na+ и Са2+ [8]. Экстрасистола в III группе появлялось уже после нанесения электрического стимула через 0,225 с, тогда

Таблица 1

Изменение веса тела и сердца крыс

Группы	n	mТ, г	Глюкоза, моль/л	mС/mТ, мг/г	mЛЖ/m C, мг/мг	Площадь зоны рубца,%
I	12	298±23,7	6±0,37	3,29±0,21	0,645±0,013	-
II	11	242±11,17*#	7±0,13#	6,27±0,33*#	0,687±0,016*	51,3±8,9
III	8	160±14,8*	27±2,75*	3,77±0,31	0,676±0,014	-
IV	8	221±4,51*	18±1,79*	3,37±0,11	0,673±0,019	46,1±2,7

Примечание: n – количество животных, mС – масса сердца, mТ – масса тела, mЛЖ – масса левого желудочка. * p<0,01 статистическая значимость различий по сравнению с I группой, # – р<0,01 статистическая значимость различий по сравнению с IV группой.

как ЭС сокращение миокарда животных в остальных группах возникало только при воздействии электрическим стимулом через 0,25 с. Как известно, экстрасистоличес-

кий стимул вызывает инотропный ответ только в случае, если воздействие попадает в фазу относительной реф-рактерности [9]. Из этого следует, что развитие диабета

Рис. 1. Динамика экстрасистолических сокращений миокарда крыс с постинфарктным кардиосклерозом и диабетическим поражением.

Примечание: по оси ординат – амплитуда сокращений в процентах по отношению к регулярным сокращениям; по оси абсцисс – длительность ЭС интервала в секундах; * – p<0,001 в сравнении с I группой, # – p<0,01 в сравнении с III группой, h – p<0,01 в сравнении со II группой; здесь и далее.

приводит к укорочению фазы абсолютной рефрактерности и повышению возбудимости клеток сердца. Кроме того, амплитуда ЭС сокращений III группы после коротких ЭС интервалов была на 20% выше, чем в I группе (рис. 1). Динамика экстрасистолического сокращения миокарда животных IV группы была сходна с реакцией I группы (рис. 1). Как видно из полученных результатов, сочетание ишемического и диабетического поражения миокарда парадоксально способствует уменьшению выраженности изменений динамики ЭС сокращений, полученных на фоне ПИКС и диабета в отдельности.

Как известно, внеочередной электрический импульс инициирует дополнительное поступление внеклеточных ионов кальция в миоплазму кардиомиоцитов. Эти дополнительные Са2+ аккумулируются в СР и участвуют в первом ПЭС сокращении, амплитуда которой превышает значение регулярного цикла [9]. Как видно из рисунка 2, ПЭС потенциация во II группе практически не наблюдалась.

Рис. 2. Постэкстрасистолические сокращения миокарда крыс с постинфарктным кардиосклерозом и диабетическим поражением

Амплитуда ПЭС сокращений в таком миокарде была чуть больше исходных значений вне зависимости от длительности ЭС интервала. Этот факт свидетельствует о значительном снижении депонирующей функции СР. Скорее всего, это связано с тем, что в условиях постинфарктного ремоделирования миокарда крыс в кардиомиоцитах нарушается работа систем СР, ответственных за реализацию функций захвата и выброса ионов кальция [10]. В III группе ПЭС потенциация миокарда была достоверно меньше в сравнении с I группой (рис. 2). ЭС воздействие с короткими интервалами вызывало повышение ПЭС сокращения на 27–19% в IV группе (рис. 2), что свидетельствует о лучшем сохранении Са2+ – депонирующей способности СР.

Таблица 2

Скорость потребления кислорода и дыхательный контроль митохондрий сердца крыс в различных экспериментальных моделях

Группы	Скорость потребления кислорода, нМО /мин на мг белка		ДК
	Исходно	На фоне бромфенацилбромида
I	10,5±1,8	10,6±1,4	3,4
II	44,7±2,8*	38,0±1,7*#	2,0
III	35,2±3,5*	21,1±2,4*#	1,9
IV	20,9±1,5*	11,6±1,5*#	2,3

Примечание: в скобках указана степень снижения величины ДК по отношению к ДК интактных животных; * – р<0,01 различия по отношению к I группе; # – р<0,01 различия в каждой группе между исходным показателем и на фоне бромфенацил-бромида; ДК – дыхательный контроль.

Исследование скорости дыхания митохондрий кардиомиоцитов показало, что скорость исходного поглощения кислорода II, III и IV групп значительно превышала значения I группы (табл. 2). Наблюдаемое увеличение потребления кислорода может быть обусловлено протонофорным действием жирных кислот [11] и разобщением окисления и фосфорилирования в митохондриях. Действительно, при добавлении в среду измерения АДФ мы получили выраженное снижение величины дыхательного контроля II и III групп. Однако в IV группе при добавлении АДФ величина дыхательного контроля оказалась наиболее близкой к значениям I группы. Как известно, при сердечно-сосудистых патологиях отмечается повышение активности эндогенных фосфолипаз и, как следствие, накопление свободных жирных кислот [12], которое провоци- рует разобщение процессов окисления и фосфорилирования [11]. Ингибирование фосфолипазы А2 при помощи бромфенацилбромида не изменило скорость дыхания митохондрий в I группе, однако в остальных группах этот показатель достоверно снижался (табл. 2). Это подтверждает факт повышения активности фосфолипазы А2 при развитии патологических состояний. Полученные данные свидетельствуют о том, что нарушение процессов энергетического метаболизма кардиомиоцитов наименее выражено в группе животных с сочетанной патологией.

Результаты исследований позволяют говорить о том, что индукция диабета на фоне формирования постинфарктного ремоделирования сердца парадоксально способствует сохранению в кардиомиоцитах функциональной активности систем ионного транспорта, отвечающих, в частности, за работу СР как внутриклеточного депо Са2+, а также способствует лучшему сохранению энергетического метаболизма. Возможно, это связано с гликозилированием мембран кардиомиоцитов в условиях гипергликемии, что приводит к увеличению ригидности мембран и препятствует избыточному притоку Са2+ в миоплазму [13]. Другой фактор, обеспечивающий адаптивные реакции при сочетанном развитии постинфарктных и диабетических нарушений миокарда, может быть связан с особенностями внутриклеточного энергетического метаболизма. Видимо, повышение уровня глюкозы на начальных стадиях развития ПИКС стимулирует процессы гликолиза в кардиомиоцитах. Известно, что положительный эффект глюкозы на работу сердца при экспериментальной ишемии миокарда связан с повышением гликолитической продукции АТФ [14]. Вероятно, в результате сдвига энергетического метаболизма в сторону гликолитической продукции АТФ сохраняется функциональная активность Са2+-транспортирующих насосов СР, поскольку АТФ, образующаяся в процессе гликолиза, является незаменимым источником энергии для Са2+-АТФазы ионного насоса СР [14]. Вместе с тем установленные нами данные согласуются с результатами об ишемической резистентности миокарда животных с небольшим сроком стрептозотоцин-индуцированного диабета [6, 15].

Таким образом, в эксперименте индукция сахарного диабета на стадии формирования постинфарктного ремоделирования повышает адаптивные возможности миокарда, что способствует сохранению ритмоинотропных реакций миокарда, связанных с работой кальций-транс-портирующих систем СР, а также способствует менее выраженному нарушению энергетического метаболизма.

Работа подготовлена по материалам исследований, финансируемых Министерством образования и науки в рамках ФЦП “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2012 годы” (ГК № 02.527.11.0007) и гранта 7 Рамочной программы Рос-сия-ЕС (№ 241558).