Сопряженность цитокинового профиля супернатанта инвазивной карциномы молочной железы с ее молекулярными и гистопатологическими характеристиками

В ряде работ показано, что различные цитокины, в зависимости от их концентрации, могут как усиливать, так и ингибировать рост злокачественной опухоли молочной железы, а также процесс ее метастазирования [1–4]. К таким цитокинам отнесены IL-1, IL-6, IL-8, IL-18, IL-19, G-CSF, GM-CSF и TGF-β, изменение концентрации которых в крови может быть сопряжено с прогрессированием рака молочной железы (РМЖ) [5–9]. Однако механизмы, лежащие в основе такой взаимосвязи, изучены недостаточно, так как большинство данных о роли цитокинов в опухолевой прогрессии основано, как правило, только на соотнесении концентраций определенных цитокинов, обнаруженных в сыворотке крови, с темпами роста опухоли и метастазированием [4, 6, 10, 11].

По современным представлениям, метастазирование злокачественных опухолей, в том числе и РМЖ, рассматривается как сложный многоэтапный процесс, который зависит от множества факторов: размеров и скорости роста опухоли, ее локализации, интенсивности ангиогенеза и развития сосудистой сети, степени злокачественности опухолевых клеток, которая определяется множеством цитофизиологиче-ских характеристик, включающих пролиферативную активность, способность к инвазивному росту, миграции и др., зависящих, в свою очередь, от молекулярного подтипа [10, 11–14]. Важнейшим фактором, способствующим метастазированию злокачественной опухоли, является внутриопухолевый ангиогенез, к одному из маркеров которого относят молекулу CD34, которая экспрессируется на большинстве клеток эндотелия кровеносных сосудов [15–18].

Показано, что повышенный уровень экспрессии CD34 в опухоли молочной железы может быть ассоциирован с неблагоприятным прогнозом и снижением продолжительности жизни онкологического больного [16, 17]. Тем не менее оценка только одного уровня экспрессии CD34 в опухоли, так же как и некоторых других маркеров опухолевого роста, не может являться достаточно надежным и точным параметром, величина которого может указывать на вероятность метастазирования в РЛУ [7, 16–21]. По этой причине возникает необходимость поиска других дополнительных факторов, условий или биологических маркеров, оценка которых в совокупности могла бы повысить вероятность прогнозирования метастазирования рака молочной железы, в том числе и на основе оценки экспрессии в опухоли CD34. В связи с этим с теоретической и практической точки зрения представляет интерес исследование взаимосвязи между цитокинами, продуцируемыми клетками ИКНТ, экспрессией CD34, гистопатологическими параметрами ИКНТ и метастазированием ИКНТ в РЛУ.

Цель исследования – изучение сопряженности между показателями цитокинового профиля супернатантов биоптатов инвазивной карциномы молочной железы неспецифического типа, ее молекулярными и гистопатологическими параметрами, экспрессией CD34, как маркера ангиогенеза, и показателями метастазирования в регионарные лимфатические узлы.

Материал и методы

Исследовали биоптаты инвазивной карциномы молочной железы неспецифического типа II степени злокачественности и супернатанты, полученные при их культивировании in vitro от 28 женщин в возрасте 37–60 лет, проходивших лечение в Новосибирском областном онкологическом диспансере. Пациентки включены в исследование по следующим критериям: впервые выявленный рак молочной железы, по поводу которого не проводилась предоперационная терапия. Критерии исключения: гематогенные метастазы, сопутствующие эндокринные заболевания, обострение хронических, воспалительных, аутоиммунных и инфекционных заболеваний. Пациентки были разделены на 2 группы. В I группу включено 13 пациенток с метастазами в РЛУ, во II группу – 15 пациенток без метастазов в РЛУ.

Биоптаты ИКНТ (объемом 8 мм3) получали методом трепанобиопсии, помещали во флакон, содержащий 1 мл среды DMEM-F12, и инкубировали при 37 °С в течение 72 ч для получения супер-нататов, содержащих цитокины, продуцируемые клетками биоптатов [22]. Далее биоптаты ИКНТ извлекали из среды и фиксировали в нейтральном растворе формалина для проведения дальнейшего иммуногистохимического и патогистологического исследования. С целью получения чистого супернатанта оставшиеся во флаконах клетки опухоли осаждали центрифугированием в режиме 900 g в течение 15 мин. Концентрацию цитокинов в супернатантах биоптатов (КЦСБ) определяли (в пг/мл) с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Оценивали КЦСБ следующих цитокинов: IL-1β, IL-1Ra, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, G-CSF, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, VEGF-A и MCP-1. ИФА-анализ проводили с использованием наборов реагентов производства АО «Вектор-Бест».

Зафиксированные в формалине биоптаты ИКНТ обезвоживали и заключали в парафин. Процессы депарафинизации и регидратации образцов ИКНТ проводили по стандартной методике с использованием проводки ксилол-этанол. Процедуру демаскировки антигенов на срезах ИКНТ проводили в цитратном буфере (рН=6,0) при температуре 95 °С в течение 20 мин. Блокирование эндогенной пероксидазы проводили в 1 % водном растворе Н2О2 в течение 5 мин. Чтобы уменьшить уровень неспецифического окрашивания срезов, их предварительно инкубировали с нормальной блокирующей неиммунной кроличьей сывороткой (VECTASTAIN Elite ABC Kit, США) в течение 10 мин.

Иммуногистохимическое выявление экспрессии CD34 проводили по следующей схеме: 1) инкубация срезов в растворе (BD 559148, США) с антителами к CD34 (sc-7324, Santa Cruz, США) в разведении 2,0 мкг/мл в течение 1 ч; 2) инкубация с биотинилированными антителами (VECTASTAIN Elite ABC Kit, Vector Laboratories, PK-7200, США) – 30 мин; 3) инкубация с авидин-пероксидазным комплексом (VECTASTAIN Elite ABC Kit) – 30 мин; инкубация в хромогенном субстрате, содержащем диаминобензидин (ImmPACT DAB, Vector Laboratories, SK-4105, США) – 5 мин. Уровни экспрессии рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа Her2/neu, рецепторов к эстрогену (ER) и прогестерону (PR), а также маркера пролиферации Ki67 оценивали в образцах ИКНТ по методикам [21], рекомендованным для определения молекулярно-генетических субтипов рака молочной железы (Gallen International Expert Consensus, 2011). Определение рецепторного статуса по ER и PR проводилось с использованием набора ER/ PR pharmDx Kit (K4071, Dako). Для определения HER2/neu статуса использовали набор Ultra View Universal DAB Detection Kit (антитела 4B5). Белок Ki67 (клон MIB-1) выявляли при использовании набора диагностических антител фирмы «Dako». Все срезы, окрашенные иммуногистохимическим методом, докрашивали гематоксилином, дегидратировали и заключали в бальзам.

Степени дифференцировки опухолевых клеток оценивали по различным цитоморфологи-ческим критериям [24]: степени выраженности клеточного полиморфизма, величине ядерно-цитоплазматического отношения, способности к структурообразованию. Для высокодифференцированных опухолевых клеток (ВДОК) были характерны следующие признаки: форма, приближенная к нормальному фенотипу клеток, преобладание цитоплазмы над ядром, способность формировать железистые структуры. Низкодифференцированные опухолевые клетки (НДОК) отличались выраженным полиморфизмом, высоким ядерно- цитоплазматическим отношением, отсутствием способности к формированию железистых структур, наличием большого количества митозов, включая патологические. Умереннодифференцированные опухолевые клетки (УДОК) характеризовались как тип клеток, занимающих промежуточное положение между ВДОК и НДОК по наличию и степени выраженности перечисленных признаков. Пролиферативную активность клеток определяли по доле опухолевых клеток, экспрессирующих Ki67 (%). Также подсчитывали среднее количество (%) митозов (МТ), патологических митозов (ПМТ) и внутрисосудистых опухолевых эмболов (ВСОЭ) по результатам анализа 10 полей зрения.

Корреляционный анализ (по Спирмену), вычисление медиан и 25–75 процентилей, а также оценку значимости различий между группами (непараметрическим методом по U-критерию Манна–Уитни) проводили с помощью программного пакета «Statistica V.7». ROC-анализ полученных данных проводили с помощью пакета программ «IBM SPSS Statistics V. 22.0».

Результаты

При корреляционном анализе полученных данных установлено, что между КЦСБ ИКНТ и гистопатологическими характеристиками ИКНТ в группах пациенток с наличием (I группа) или отсутствием метастазов в РЛУ (II группа) выявляются различные по характеру связи (табл. 1). В I группе выявлены корреляционные связи между рядом гистопатологических параметров (HER2/neu,

Таблица 1/table 1

Корреляционные связи между КЦСБ ИКНТ и гистопатологическими характеристиками ИКНТ при наличии и отсутствии метастазов в РЛУ

Correlations between the CCsB of iBC-nst and histopathological characteristics of iBC-nst in the presence and absence of metastases in Rlns