Состав и содержание антоцианов в диетических сортах картофеля (Solanum tuberosum L.), перспективных для выращивания и селекции в условиях Дальнего Востока России

Антоциановые пигменты могут синтезироваться в кожуре и мякоти клубней картофеля. Кроме того, окрашенными могут быть цветки, листья, стебли и глазки. У картофеля как важной продовольственной культуры содержание антоцианов целесообразно повышать в съедобной части растения — мякоти клубней (3).

Антоциановые пигменты используются в пищевой и фармацевти-

Исследования выполнены в рамках КПНИ развития сельского хозяйства РФ на 2017-2025 годы (подпрограмма «Развитие селекции и семеноводства картофеля в Российской Федерации»).

ческой промышленности. Они относятся к водорастворимым природным красителям — антиоксидантам, способным окрашивать продукты питания в разные оттенки красного (альтернатива канцерогенному азокрасителю кармуазину) и рекомендованы российскими санитарными правилами и нормами для подкрашивания некоторых видов сыров, вин, безалкогольных напитков, консервированные овощей, сухих завтраков (до 200 мг/кг), джемов, желе, мармеладов (4, 5).

Известно, что антоцианы обладают капилляроукрепляющими, антиоксидантными, антибактериальными и антиканцерогенными свойствами и применяются в медицине для лечения и профилактики ряда заболеваний (например, сахарного диабета II типа и некоторых форм опухолей) (6-9).

Повышение эффективности селекции по признакам окраски мякоти клубня (красная и фиолетовая) связывают с разработкой ДНК маркеров целевых генов биосинтеза антоцианов на основе применения ПЦР-анализа. Известно, что в генетическом контроле биосинтеза антоцианов участвуют структурные гены ферментов халконсинтазы (CHS), халконфлаванонизоме-разы (CHI), дигидрофлавонол-4-редуктазы (DFR), флавонон-3-гидрокси-лазы (F3H), флавоноид-3´-гидроксилазы (F3 ʹ H), флавоноид-3´,5´-гидрок-силазы (F3´5´H) и антоцианидинсинтазы (ANS) (10, 11). У S. tuberosum также обнаружены локусы, соответствующие регуляторным генам. Локус D ( developer , у диплоидного картофеля S. rybinii Juz. & Bukasov обозначен как I — inhibitor ), расположенный в 10-й хромосоме, кодирует транскрипционный фактор (ТФ) R2R3 MYB, обладающий высоким сходством с продуктом ранее выделенного гена петунии ( Petunia hybrid ) — PhAN2 (12). Представители R2R3 MYB — самая большая группа генов, кодирующих ТФ у растений. Они выполняют важную роль в биосинтезе антоцианов (13-15).

Изученность генетики антоциановой пигментации клубней и цветков у селекционных форм S. tuberosum существенно облегчает подбор родительских пар для скрещивания и планирование объемов селекционного материала при отборе гибридов с окрашенными цветками, стеблями, листьями и клубнями (16-18).

Пигментированные сорта картофеля S. tuberosum богаты антоцианами, в частности их ацилированными производными (19). Генотипы картофеля сильно различаются по содержанию биологически активных соединений, в том числе антоцианов. Пигментированные сорта обладают в 1,52,5 раза большей фенольной активностью, в 2-3 раза большей антиоксидантной способностью и накапливают больше антоцианов, чем непигмен-тированные генотипы. В непигментированном картофеле антоцианы не обнаружены (20).

В США селекционная работа по созданию специальных диетических сортов ведется с начала 2000 годов, в результате получены сорта с высоким содержанием каротиноидов и антоцианов, имеющие красную и фиолетовую мякоть клубней (4). В России также достигнуты значительные успехи в создании сортов картофеля для диетического питания, проводятся исследования по определению суммарного содержания антиоксидантов в сортообраз-цах картофеля, выделены сорта, которые имеют наибольший индекс пигментации и содержат в 5 раз больше антикосидантов, чем беломякотные сорта (21).

На Дальнем Востоке работы по увеличению содержания антоцианов в клубнях картофеля начаты в 2018 году. При оценке сортов различного происхождения (Россия, Нидерланды, Германия, Казахстан, Украина и Беларусь) выделены источники ценных хозяйственных признаков (повышенная урожайность, красная и фиолетовая окраска кожуры клубня, красно-996

фиолетовая окраска венчика), которые включены в скрещивания с целью получения диетических сортов (22). Для дальнейшей селекционной работы необходимо дополнительное изучение диетических антиоксидантных свойств у выделенных ранее сортов, анализ состава и содержания антоцианов в клубнях и сопоставление этих данных с наличием антоциановой окраски других органов (кожура и венчик цветка) у пигментированных сортов для выявления связи этих признаков.

В представленном исследовании с применением методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии второго порядка мы идентифицировали антоцианы и измерили их содержание у 22 сортов картофеля различного происхождения, которые ранее не были охарактеризованы по этому признаку. Впервые выделены четыре сорта российского происхождения с повышенным содержанием антоцианов для диетического использования.

Целью работы было определение состава и количественного содержания антоцианов в клубнях диетических сортов картофеля, перспективных для выращивания и селекции на Дальнем Востоке России.

Методика. Сорта картофеля (мировая коллекции ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова — ВИР, г. Санкт-Петербург; коллекция Всероссийского НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха, Московская обл.; сорта, полученные в ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки) изучали в коллекционном питомнике (ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, 20162018 годы). По признакам раннеспелости (продуктивность 440-650 г/куст на 60-е и 70-е сут после посадки) и окраске клубней была сформирована выборка из 22 сортов: Башкирский, Василек, Дачный, Казачок, Крепыш, Куз-нечанка, Матушка, Маяк, Метеор, Огниво, Ольский, Памяти Кулакова, Сарма, Сиреневый туман, Фиолетовый, Янтарь (Россия), Sante (Сантэ) (Нидерланды), Vitesse (Германия), Тамыр (Казахстан), Повiнь, Щедрик (Украина), Манифест (Беларусь).

Состав и накопление антоцианов анализировали по методу C.E. Lewis с соавт. (20). Для определения содержания антоцианов использовали ткани мякоти клубней (вместе с кожурой). Собранные образцы хранили до начала анализа (не более 2 нед) в прохладном месте без доступа прямых солнечных лучей. Образцы промывали в холодной воде, взвешивали, измельчали и заливали раствором, содержащим 40 % этилового спирта и 1 % муравьиной кислоты (5 г измельченной массы + 25 мл полученного раствора). Массу подвергали замораживанию-размораживанию, а также ультразвуковой дезинтеграции для разрушения стенок и мембран клеток и органелл. Атоцианы экстрагировали в течение 90 мин при 40 ° С в закрытом сосуде для предотвращения доступа атмосферного кислорода. Экстракт центрифугировали (СМ-6М, «Elmi», Латвия) при 3500 g в течение 30 мин, супернатант фильтровали через шприцевые фильтры (размер пор 0,45 мкм). Готовый экстракт хранили в морозильной камере при температуре - 20 ° С.

Антоцианы разделяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе с градиентным насосом высокого давления LC-20AD и блоком термостатирования колонок CTO-20A («Shimadzu», Япония). Хроматографию проводили на обратнофазной колонке Shodex C18-4E (250½4,6 мм), диаметр зерна сорбента — 5 мкм («Shodex», Япония), температура 50 ° С, скорость подвижной фазы составляла 0,58 мл/мин. Элюент А — ацетонитрил («AppliChem GmbH», Германия), элюент B — 1% раствор муравьиной кислоты («Sigma-Aldrich», США). Градиент: 0,00-5,00 мин — концентрация B изменялась от 100 % до 92 %; 5,00-45,00 мин — концентрация B изменялась от 92 % до

80 %; 45,00-45,01 мин — концентрация B изменялась от 80 % до 10 %. Детектирование проводили в диапазоне длин волн 300-600 нм UV/VIS спектрофотометрическим детектором SPD-20A («Shimadzu», Япония). Для анализа вводили по 5 мкл экстракта. Анализ проводили в 66 биологических и 3 аналитических повторностях. Для сортов Фиолетовый и Василек содержание антоцианов пересчитывали по мальвидин-3-глюкозиду, используя коэффициент поглощения 3,02½104 в диапазоне длин волн 300-600 нм и молекулярную массу 493,3 г/моль, для остальных сортов — по пеларгони-дин-3-глюкозиду с молярным коэффициентом экстинкции 2,73½104 при диапазоне длин волн 300-600 нм и молекулярной массой 433,3 г/моль.

Антоцианы идентифицировали методами масс-спектрометрии второго порядка с помощью ловушки amaZon SL («Bruker», Германия), оснащенной источником ионизации электрораспылением. Для этого выделенные ранее методом ВЭЖХ антоцианины анализировали методом прямого ввода. Детектирование проводили в режиме положительных и отрицательных ионов. Диапазон сканирования масс — от 150 до 2200 а.е.м., максимальная скорость сканирования 32000 Да/с, напряжение на распыляющем капилляре 4500 В, давление на небулайзере 29 psi, поток сухого газа 10 л/с, температура капилляра 180 ° С. Фрагментацию ионов проводили электронным пучком с энергией 1,5 эВ. Анализ проводили в 66 биологических и 3 аналитических повторностях.

Для проверки достоверности полученных результатов использовали статистические программы MS Excel 2007 и Statistica 8 («StatSoft, Inc.», США), рассчитывали средние ( M ) и t 0,05 ½SEM.

Результаты . Выделенная группа сортов характеризовалась низкой крахмалистостью (8,0-12,0 %) и имела розовую и фиолетовую окраску кожуры. Известно, что низкокрахмалистые образцы относятся к группе сортов для диетического использования (23).

Антоциановая окраска разных частей растений — важный признак, который можно эффективно использовать в селекции на повышенное содержание пигментных веществ фенольной природы (5). Изученные нами сорта различались по морфологическим признакам клубней (табл. 1).

1. Морфологические признаки изученных сортов картофеля ( Solanum tuberosum L.) (коллекционный питомник ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, 2016-2017 годы)

Сорт	Окраска
	мякоти клубня	венчика соцветия	кожуры клубня
Sante, Казачок, Vitesse,	Желтая	Белая	Желтая
Сарма, Метеор
Крепыш	Белая	Бледно-красно-фиолетовая с белым лучом
Дачный, Щедрик	Белая	Белая
Янтарь	Ярко-желтая	Белая
Тамыр	Светло-желтая	Белая
Ольский	Кремовая	Белая	Желтая с розо-
Памяти Кулакова	Белая	Белая	выми пятнами
Кузнечанка, Башкирский	Белая	Бледно-красно-фиолетовая	Розовая
Сиреневый туман	Светло-желтая	Бледно-красно-фиолетовая с белым лучом
Повiнь	Желтая	Бледно-красно-фиолетовая
Матушка	Кремовая	Белая
Огниво	Кремовая	Красно-фиолетовая с белым лучом
Маяк	Кремовая	Бледно-красно-фиолетовая	Темно-розовая
Манифест	Кремовая	Красно-фиолетовая с белым лучом
Василек	Кремовая	Сине-фиолетовый с белым лучом	Фиолетовая
Фиолетовый	Фиолетовая	Сине-фиолетовая с белым лучом	Сине-фиолетовая

Пять образцов картофеля (Казачок, Метеор, Сарма, Sante, Vitesse) характеризовались белой окраской венчика соцветия, но желтой кожурой и мякотью. У остальных сортов пигментация частей растений была неоди- наковой (желтая, оттенки красно-фиолетового, фиолетовая, розовая и т.д.). Морфологические признаки, отмеченные в наших исследованиях (окраска генеративных органов и кожуры клубней в период цветения), соответствуют известным описаниям (24).

В результате определения антоцианового профиля в клубнях было выявлено пять различных антоцианов (табл. 2). Масс-спектрометрия второго порядка идентифицировала выделенные антоцианы как дельфинидин, петунидин, мальвидин, цианидин и пеларгонидин. Согласно данным литературным, биохимическая природа антоцианов у S. tuberosum такая же, как у культурных диплоидных видов (25). В состав их антоцианов входят пеларгонидин, пеонидин, петунидин и мальвидин.

• 2.    Антоциановый профиль клубней у изученных сортов картофеля ( Solanum tuberosum L.) по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии и МС-МС масс-спектрометрии (коллекционный питомник ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, 2018 год)

• 3.    Содержание (мг/кг) антоцианов в клубнях у изученных сортов картофеля (Solanum tuberosum L.) (n = 3, M±t0,05½SEM, коллекционный питомник ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, 2018 год)

  Сорт     1	1 ZZ 2 zz 3 zz 4zz 5 1	6 1	7
  	Желтая окраска кожуры клубня
  Sante	< 0,5        < 0,5       1,0±0,1       < 0,5        < 0,5	< 0,5	< 0,5
  Казачок	< 0,5        < 0,5        < 0,5        < 0,5       2,1±0,1	< 0,5	< 0,5
  Vitessa	< 0,5        < 0,5        < 0,5       0,9±0,1       < 0,5	< 0,5	< 0,5
  Сарма	< 0,5        < 0,5        < 0,5       2,2±0,1       < 0,5	< 0,5	< 0,5
  Метеор	< 0,5        < 0,5       1,1±0,1      1,8±0,1       < 0,5	< 0,5	< 0,5
  Дачный	< 0,5        < 0,5       1,0±0,1       < 0,5        < 0,5	< 0,5	< 0,5
  Щедрик	< 0,5        < 0,5        < 0,5        < 0,5        < 0,5	< 0,5	< 0,5
  Янтарь	< 0,5        < 0,5        < 0,5        < 0,5       1,8±0,1	< 0,5	< 0,5
  Тамыр	< 0,5        < 0,5        < 0,5        < 0,5       2,0±0,1	< 0,5	< 0,5
  Крепыш	< 0,5        < 0,5        < 0,5        1,2±0,1       < 0,5	< 0,5	< 0,5
  Жел	тая окраска кожуры клубня с розовыми пятнами
  Ольский	< 0,5        < 0,5        < 0,5       5,3±0,1       < 0,5	<0,5	< 0,5
  Памяти Кулакова	< 0,5        < 0,5        < 0,5       3,2±0,1       < 0,5 Розовая окраска кожуры клубня	< 0,5	< 0,5
  Кузнечанка	4,1±0,1     9,7±0,1       < 0,5      78,4±0,3      < 0,5	< 0,5	< 0,5
  Башкирский	0,9±0,1     3,1±0,1       < 0,5      24,8±0,2     2,3±0,1	< 0,5	< 0,5
  Сиреневый туман	2,7±0,1      < 0,5      12,1±0,1      5,0±0,1      < 0,5	< 0,5	< 0,5
  Повiнь	3,0±0,1     7,3±0,1       <0,5      24,8±0,2     5,0±0,1	< 0,5	10,2±0,1
  Матушка	< 0,5       1,1±0,1       <0,5      22,2±0,2     0,7±0,1	< 0,5	< 0,5
  Огниво	1,3±0,1      < 0,5        <0,5       1,9±0,1      < 0,5 Темно-розовая окраска кожуры клубня	< 0,5	< 0,5
  Маяк	2,1±0,1     2,1±0,1       <0,5      94,6±0,3     9,9±0,1	< 0,5	< 0,5
  Манифест	1,0±0,1     1,2±0,1       <0,5      20,1±0,2     1,1±0,1 Фиолетовая окраска кожуры клубня	< 0,5	< 0,5
  Василек	< 0,5      5,0±0,1       <0,5      38,2±0,2  149,8±0,4 Сине-фиолетовая окраска кожуры клубн	< 0,5 я	2,0±0,1
  Фиолетовый	30,4±0,2      < 0,5      50,1±0,2      < 0,5      5,1±0,1	310,0±0,4	8,4±0,1
  П р и м е ч а н и е.	1 — дельфинидин-3-глюкозид, 2 — дельфинидин-3-рамнозил-5	-глюкозид, 3	— мальви-
  дин-3-глюкозид, 4 — пеларгонидин-3-глюкозид, 5 — петунидин-3-глюкозид, 6 — 7 — цианидин-3-рамнозил-5-глюкозид.		цианидин-3	-глюкозид,

Антоциан Молекулярный ион [M+H]+ Время выхода на ВЭЖХ, мин Сорт Дельфинин-3-глюкозид 465,3; 303,2 25 Маяк, Повiнь, Кузнечанка, Мани- Дельфинин-3-рамнозил-5- 627,3; 465,3; 303,2 17,5 фест, Фиолетовый Маяк, Повiнь, Кузнечанка, Василек, глюкозид Мальвидин-3-глюкозид 493,3; 331,3 44 Манифест Фиолетовый Пеларгонидин-3-глюкозид 433,3; 271,1 37,5 Маяк, Повiнь, Кузнечанка, Фиолето- Петунидин-3-глюкозид 479,3; 317,2 35 вый, Василек Василек, Манифест, Матушка, Повiнь Цианидин-3-глюкозид 449,2; 287,2 27,5 Мали, Сиреневый туман, Памяти Кулакова, Ольский Фиолетовый Цианидин-3-рамнозил-5- 611,3; 499,3; 287,2 19 Матушка, Василек, Фиолетовый, глюкозид                                                     Повiнь

Антоцианы дельфинин и цианидин обнаружили как в моногликози-лированной, так и в дигликозилированной форме. Наиболее распространенными антоцианами в образцах были петунидин-3-глюкозид и пеларго-нидин-3-глюкозид: их идентифицировали практически во всех исследованных образцах (табл. 3).

По данным литературы, петунидин и пеларгонидин — это основные антоцианы, встречающиеся в картофеле. Петунидин обусловливает пурпурную окраску, а пеларгонидин — красно-оранжевую (20, 26). При исследовании сортов с розовой и темно-розовой окраской клубня мы выявили превалирующее присутствие пеларгонидин-3-глюкозида, сорта с фиолетовой и сине-фиолетовой окраской содержали преимущественно петунидин-3-глю-козид. В образцах с желтой окраской кожуры антоциановые вещества детектировали либо в незначительном количестве, либо их не обнаружили.

Наибольшее содержание антоцианов было характерно для сортов Фиолетовый, Василек, Маяк и Кузнечанка. Сорт Фиолетовый, у которого кожура и мякоть клубня сине-фиолетовые, выделялся значительным содержанием четырех антоцианов — цианидин-3-глюкозида (310 мг/кг), мальвидина (50 мг/кг), дельфинидина (30 мг/кг) и цианидин-3-рамнозил-5-глюкозида (8 мг/кг). Сорта Маяк и Кузнечанка имели розовые и темнорозовые клубни и выделились повышенным содержанием пеларгонидина — соответственно 95 и 78 мг/кг. Сорт Василек с фиолетовой кожурой клубней характеризовался самым высоким содержанием петунидин-3-глюкозида — 150 мг/кг. Выделенные сорта могут быть использованы в качестве функционального продукта питания с высокими антиоксидантными свойствами.

В клубнях сорта Фиолетовый цианидин-3-глюкозид оказался основным компонентом (рис.).

Профиль элюции антоцианов, выделенных из клубней картофеля ( Solanum tuberosum L.) сорта Фиолетовый ( n = 3, коллекционный питомник ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, 2018 год) . Метод ВЭЖХ, обратнофазная колонка Shodex C18-4E (250½4,6 мм), элюент А — ацетонитрил («AppliChem GmbH», Германия), элюент B — 1 % раствор муравьиной кислоты («Sigma-Aldrich», США). Градиент: 0,00-5,00 мин. Пик цианидин-3-глюкозид — 27,5 мин, мальвидин-3-глюкозида — 44 мин, дельфинин-3-глюкозида — 25 мин.

Наиболее интенсивный сигнал (при длине волны 371 нм) (время удерживания 27,5 мин) соответствует основному антоциану этого сорта ци-анидин-3-глюкозиду, кроме того, присутствуют в значительных количествах мальвидин-3-глюкозид (пик при 44 мин) и дельфинин-3-глюкозид (небольшой пик при 25 мин). Профили элюции выявили связь между содержанием конкретных антоцианов и окраской клубней, а также их принадлежностью к определенному сорту. Имеющиеся публикации подтверждают, что качественный состав антоцианов, как правило, специфичен для конкретного вида растений и довольно стабилен. Однако он зависит от сортовых особенностей и условий произрастания растений, которыми определяется активность соответствующих ферментов, способствующих синтезу определенных компонентов антоцианового комплекса (19, 27).

Сорта с фиолетовой и розовой кожурой разных оттенков выделились по содержанию антоцианов в клубнях по сравнению с сортообразцами с желтыми клубнями. Следовательно, окраска кожуры клубня (розовая, темно-розовая, сине-фиолетовая, фиолетовая) может использоваться в качестве визуального признака в селекции при создании диетических сортов с повышенным содержанием антоцианов.

Итак, в результате проведения масс-спектрометрии второго порядка в клубнях сортов картофеля при определении антоцианов идентифицированы дельфинидин, петунидин, мальвидин, цианидин и пеларгонидин. Наиболее распространен петунидин-3-глюкозид — его обнаружили практически во всех исследованных образцах. Наибольшее содержание антоцианов отмечено в сортах Фиолетовый, Василек, Маяк и Кузнечанка. Сорт Фиолетовый с сине-фиолетовой кожурой и мякотью клубня выделился значительным содержанием четырех антоцианов — дельфинидина (30 мг/кг), мальвидина (50 мг/кг), цианидин-3-глюкозида (310 мг/кг) и цианидин-3-рамнозил-5-глюкозида (8 мг/кг). Сорта Маяк и Кузнечанка имели клубни розовой и темно-розовой окраски и выделились повышенным содержанием пеларгонидина — соответственно 95 и 78 мг/кг. Сорт Василек с фиолетовой кожурой клубней характеризовался самым высоким содержанием петуни-дин-3-глюкозида — 150 мг/кг. Полученные результаты показали, что окраска кожуры клубня может использоваться в качестве признака при отборе и создании сортов с повышенным содержанием антоцианов. Установлено, что для клубней с розовой и темно-розовой кожурой характерно наличие пеларгонидин-3-глюкозида. Петунидин-3-глюкозид и цианидин-3-глюко-зид придают кожуре фиолетовую и сине-фиолетовую окраску. Выделенные сортообразцы картофеля диетического направления включены в селекционные программы по созданию диетических сортов. Для этого мы планируем далее изучить наследуемость желаемой антоциановой пигментации в создаваемых сортах картофеля и определить наборы генов, отвечающих за состав и содержание антоцианов в клубнях.