Состояние хряща и кости коленного сустава собак в условиях удлинения голени

ВЕДЕНИЕ

Удлинение длинных трубчатых костей в настоящее время является наиболее широко распространенным путем коррекции длины и формы конечности посредством чрескостно-дистракционного остеосинтеза (ЧДО). Поэтому внимание исследователей должно быть направлено не только на сокращение сроков лечения, но и на профилактику осложнений, в частности дегенеративных изменений в суставах образованных оперированными и сочленяющимися с ними костями. Исследования, ранее выполненные в нашем центре, показали, что при удлинении костей голени методами ЧДО в оперированной и контралатеральной конечностях развиваются изменения механических свойств и химического состава суставного хряща [1, 2, 3]. Однако остаются неразработанными вопросы состояния губчатой кости суставов, прилегающих к оперированному сегменту. Поэтому нам представилось необходимым изучить в эксперименте состояние гиалинового хряща и костной ткани коленного сустава при удлинении голени.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования послужили хрящи коленных суставов 6 беспородных собак (возраст – 1-2,5 года, длина голени – 19-21 см) с удлинением голени на 30% методом чрескост-но-дистракционного остеосинтеза по Илизарову. Удлинение осуществляли с темпом 1 мм в сутки за 4 приема, которое начинали через 5 дней после наложения аппарата Илизарова. Оперативное вмешательство и послеоперацион- ное ведение животных выполнено д.м.н. А.А. Ларионовым.

После эвтаназии животных и препарирования суставов измеряли податливость суставного хряща [4]. Хрящевую и костную ткани прецизионно взвешивали на электронных аналитических весах “Tekator” (“Sartorius”, ФРГ), лио-фильно высушивали на установке “Lyph Lock 4,5” (“Labconco”, США) и, повторно взвешивая, определяли в пробе содержание воды. В высушенных образцах хряща и кости после жесткой деградации влажным озолением или относительно мягкого кислотного гидролиза [5] определяли основные компоненты минеральной фазы и внеклеточного органического матрикса: кальций, неорганический фосфат, сульфат, гидроксипролин [6], гексозамины [7], уроновые кислоты [8], гексозы [9], а также показатели клеточной активности хондроцитов – содержание нуклеиновых кислот [10]. Кроме того, фракционировали протеогликаны (ПГ) по величине образуемых ими супрамолекулярных агрегатов [11] и определяли содержание каждой из выделенных фракций анализом на уроновые кислоты. Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики, применяемым для малых выборок, с принятием вероятности (р), равной 0,05. Достоверность различий между группами наблюдений оценивали с помощью критерия Т (парный критерий Вилкок-сона).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При макроскопическом изучении суставной поверхности коленных суставов собак с 30% удлинением голени мы наблюдали матовый, шероховатый, с фиолетовыми пятнами, истонченный хрящ толщиной 1 мм и менее. При этом обнаружили снижение вязко-упругих свойств на 48% в хряще оперированной конечности и на 52% – в контралатеральной. Степень гидратиро-ванности ткани была одинакова в обеих конечностях и составила 94,4% от нормы.

При изучении химического состава хряща (табл. 1) было обнаружено статистически достоверное снижение концентрации ГУК на 30,4% в хряще оперированной конечности и на 34,6% – в контралатеральной. Значительно увеличивалась степень сульфатирования ГАГ, на что указывает возрастание отношения сульфаты/ГУК в 1,82 раза в хряще сустава оперированной и в 2,11 раза в хряще сустава контралатеральной конечности. Одновременно в этих же пробах материала в 2,4 раза возрастало содержание гексоз. Коэффициент гексозы/ГУК в 1,82 раза в хряще оперированной и в 2,11 раза в хряще контралатеральной конечности превысил нормальные значения.

При изучении степени минерализации матрикса хряща обнаружено её увеличение в 4,3 раза в оперированной и в 4 раза в контралатеральной конечности. За столь значительное возрастание степени минерализации хряща ответственен, в первую очередь, Ca-компонент. Снижение концентрации Р было менее значительно.

При изучении биосинтетических и пролиферативных потенций хряща выяснилось, что при достоверном снижении концентрации ДНК и РНК, соотношение этих показателей увеличивалось. То есть при значительном, почти в 2 раза, уменьшении и пролиферативной и биосинтетической активности хондроцитов в клетке преобладают биосинтетические процессы.

На рисунке 1 показаны количественные соотношения фракций ПГ различной молекулярной массы и степени связи с остальными компонентами матрикса. Полученная нами картина распределения ПГ говорит о более существенных изменениях матрикса ХКС контралатеральной конечности. Так, доля ПГ, входящих в состав суперагрегатов, уменьшается в контралатеральной конечности более чем в 2 раза, в то же время как снижение доли ПГ данной группы в матриксе хряща оперированной конечности статистически недостоверно.

Кроме вышесказанного, сравнение отношений количества ГУК в выделенных фракциях ПГ из суставного хряща животных с удлинением голени и матрикса хряща интактных суставов показало, что в хряще как оперированной, так и контралатеральной конечности достоверно уменьшается доля мономеров ПГ. Количество агрегатов ПГ, не связанных с коллагеном, значительно увеличивается: на 40,2% – в хряще оперированной и на 47,0% – в хряще контралатеральной конечности.

Таблица 1

Механические свойства и химический состав хряща коленных суставов собак с 30% удлинением голени

Показатель	Оперированная конечность	Контралатеральная конечность	Интактный хрящ
Податливость	1,03 ± 0,19	0,86±0,2	2,0 ± 0,12
Н 2 О	70,16±2,28	70,32±3,11	74,78±0,45
Са	33,54±1,23	28,91±2,03	10,50±1,51
Р	4,02±0,18	3,42±0,15	5,45±0,01
Са/Р	8,34±0,39	7,76±0,54	1,94±0,32
ГУК	16,74±1,5	15,73±1,39	24,03±2,86
Гексозы	30,60±3,8	33,22±2,35	14,96±2,50
Сульфаты	26,66±2,12	21,18±4,03	29,31±3,28
Сульфаты/ГУК	1,59±0,09	1,35±0,11	1,06±0,19
ДНК	0,3±0,07	0,27±0,04	0,56±0,21
РНК	2,43±0,13	2,56±0,3	4,19±0,31
РНК/ДНК	8,1±0,12	9,48±0,37	7,70±0,62

Примечание: податливость в мм/гс х 10-3; водный компонент в г/100 г ткани; РНК, ДНК в ммоль Р/100 г сухой ткани; остальные в ммоль/100 г сухой ткани; * - р < 0,05.

а

б

в

Рис. 1. Распределение фракций протеогликанов по степени агрегации в ХКС собак II-й серии эксперимента (1 – экстрагируемые 0,15М ацетатом Na в течение 2 часов, 2 – экстрагируемые 0,15М ацетатом Na в течение 24 часов, 3 – экстрагируемые 3М MgCl 2 в течение 48 часов, 4 – фракция протеолизата): а – контралатеральная конечность, б – оперированная конечность, в – интактная

При изучении степени однородности коллагена хрящей экспериментальных животных 2-ой серии нами получен дополнительный пик коллагена, не свойственный здоровой хрящевой ткани. Пик элюировался 0,75 М концентрации NaCl и занимал площадь, равную 0,6% от совокупной площади коллагеновых фракций (рис. 2).

Соотношение коллагеновых фракций, выходящих при 0,1; 0,3 и 0,75 М NaCl, отличалось как по сравнению с хрящом здоровых животных, так и по сравнению с хрящом животных 1-ой серии эксперимента и составляло 5,7:82,65 :5,42 в хряще контралатеральной и 5,0 :73,40 :10,18 – в ХКС оперированной конечности. Дополнительный пик коллагена, выходящий при концентрации NaCl 0,65 М, составил 6,14% в хряще контралатеральной и 12,09 % – в оперированной конечности.

Проведенные биохимические исследования губчатой костной ткани мыщелков опытного и контралатерального суставов при удлинении опытной голени на 30% от ее исходной длины прежде всего выявили снижение минерального компонента внеклеточного матрикса. Так, в головке оперированной конечности убыль содержания Ca составила 7,3%; P – 15%. Отношение Са/Р, характеризующее качественный состав минеральной фазы матрикса в костной ткани мыщелков, в 2 раза превышало нормальные значения, что обусловлено, по нашему мнению, наличием фиксированного на органическом матриксе кальция. Кроме того, мы наблюдали достоверное изменение концентрации сульфата неорганического (pu <0,05). При этом отмечено достоверное расхождение между дисперсией нормальных значений и дисперсией значений как в оперированной, так и в контралатеральной конечности, что говорит о низкой степени варьирования признака и однородности наблюдаемых изменений минерального состава костной ткани мыщелка у животных второй серии эксперимента.

Рис. 2. Хроматографические профили коллагена хряща собак с удлинением голени на катионообменнике: а – контралатеральная конечность, б – оперированная конечность

При изучении показателей органической фазы матрикса кости мы не обнаружили достоверного изменения средней величины исследуемых показателей (табл. 2). Однако наблюдалось достоверное изменение значений дисперсии по F – критерию Фишера (P F < 0,05) как между костной тканью интактных и опытных животных, так и между оперированной и контралатеральной конечностями. Это является свидетельством того, что степень варьирования показателей в опытной и контралатеральной конечностях увеличивалась, т.е. ответная реакция на удлинение носила разнонаправленных характер.

Таблица 2 Химический состав губчатой кости коленного сустава собак с 30% удлинением голени от её исходной длины (2-я серия)

Показатель	Оперированная конечность	Контралатеральная конечность
Н 2 О	8,31±0,45*	8,55±0,51*
Са	17,04±0,73* ^	17,99±0,58*
Р	10,68±1,30* «	10,33±0,95* ^
Са/Р	1,59±0,64* «	1,74±0,15 *
Общие липиды	20,13±1,17	20,86±1,05
Гексозамины	5,00±0,08	5,20 ±0,41
ГУК	26,05±2,19	23,2 ±3,14
Гексозы	1,62±0,17	1,50±0,18
Сульфаты	0,39±0,016	0,55±0,11
Сиаловые кислоты	0,35±0,05	0,38±0,03

Примечание: водный компонент в г/100 г ткани; остальные в г/100 г сухой ткани; * - P U <  0,05; • - P F < 0,1

Изучение активности фосфомоноэстераз показало дальнейшее усиление костного обмена, при этом наиболее значимые изменения были обнаружены нами в губчатой ткани мыщелков контралатеральной конечности, где наблюдалось превалирование активности кислой щелочной фосфатазы (ТрКФ) над костной (КЩФ) и общей щелочной фосфатазой (ЩФ) (рис. 3).

Рис. 3. Изменение активности фосфомоноэстераз после удлинения голени на 30%

Исследование ферментных систем, связанных с процессами энергообеспечения костной ткани мыщелков животных с удлинением голени на 30% от ее исходной длины, показано на рисунке 4.

ЛДГ1 ЛДГ2 ЛДГ3 ЛДГ4 ЛДГ5

Рис. 4. Изоферментная активность собак после удлинения голени (в % от общей активности)

К моменту конца фиксации и снятия аппарата Илизарова мы обнаружили достоверные изменения активности ЛДГ5 как в оперированной, удлиняемой конечности, так и в контралатеральной, по сравнению с величинами здоровых животных (рис. 4). Кроме того, мы обнаружили достоверные изменения в общей активности данного фермента и величины Н и М субъединиц от нормальных значений (табл. 3).

Накопление молочной (МК) и пировиноградной кислот (ПВК) в костной ткани мыщелков удлиненной и контралатеральной конечностей свидетельствовало о перераспределении процессов энергетического механизма в сторону анаэробных процессов (табл. 3).

Таблица 3

Показатели гликолиза в костной ткани здоровых собак до и после удлинения голени на 30%

Показатель	Кость интактных животных	Оперированная конечность	Контралатеральная конечность
ЛДГ, Мккат/г ткани	2,80±0,13	3,60±0,21*	2,94±0,50
Н:М	1,56±0,12	1,43±0,01*	1,50±0,05
МК, Ммоль/г ткани	7,60±0,62	10,24±0,96*	9,13±0,56*
ПВК,ммоль/г ткани	0,35±0,01	0,40±0,04*	0,35±0,03
МК/ПВК	21,71±0,98	25,6±1,12*	26,08±0,79*

* - р <  0,05.

Следовательно, представленные результаты указывают на общую закономерность: при нарушении стереотипа движений в суставе в условиях общей метаболической реакции организма на остеотомию и последующее удлинение голени на 30% от её исходной длины, вызывающее компрессионные воздействия на коленный сустав, в хряще экспериментальных животных отмечаются выраженные и дегенеративнодистрофические изменения, выражающиеся в значительном снижении вязко-упругих свойств хряща, снижении его пролиферативных потенций и общей деградации матрикса. Изменения костной ткани мыщелков затрагивали прежде всего изменения степени минерализации матрикса и нарушения однородности коллагена. Накопление продуктов анаэробного гликолиза, увеличение активности ТрКФ свидетельствовало о глубокой перестройке процессов энергообеспечения и ремоделирования костной ткани, что приводило к усилению фазы катаболизма. Патологические изменения хряща и костной ткани контралатерального сустава возникали вследствие перераспределения нагрузки между конечностями.