Состояние окислительных процессов в образцах тестикулярной ткани после ионизирующего излучения

Радиация является одним из наиболее опасных факторов окружающей среды, влияющих на здоровье человека. В последнее время радиационный риск повышается из-за широкого применения в самых разных областях человеческой деятельности, особенно в медицине, технике и промышленности. Поэтому проблема нежелательных влияний радиации на организм человека и, особенно, на его репродуктивную систему, всё ещё остаётся актуальной для биологии и медицины. Важно почеркнуть, что в литературных данных имеются раздельные сведения об отрицательных воздействиях различных доз радиации, внешнего и внутреннего типа облучения на морфологическое и функциональное состояние мужской репродуктивной системы [1, 2, 3] . Мамина и др. показали структурно-функциональное повреждение семенников при условии повышенного радиационного фона, в том числе однократного внешнего облучения [4, 5] .

Литературные данные подтверждают, что вредные эффекты наблюдаются при применении радиации в диагностических и лечебных целях разных заболеваний. Так, было отмечено снижение активности клеток мужской репродуктивной системы, вырабатывающихся мужским половым гормоном – тестостероном, а также изменение концентрации мужских половых гормонов, поэтому для проведения диагностики и лечения разных заболеваний необходимо обратить внимание на то, чтобы дозировки облучения были с минимальным воздействием на здоровые органы обследуемых [6, 7, 8].

Одним из важных негативных воздействий ионизирующего излучения является создание окислительного стресса, который вызывает крупномасштабное разрушение или повреждение различных биомолекул.

Учитывается, что семенники имеют первостепенное значение для размножения и эволюции вида, а также выполняют две основные функции: выработка половых клеток (сперматозоидов) и синтез/ секреция гормонов (в первую очередь тестостерона). Поэтому они являются тканями с высокой потребностью энергии, выполняющими энергозатратные процессы [9] .

Однако применение кислорода во многих важных метаболических процессах живыми системами обошлось в эволюционную цену, поскольку метаболизм кислорода может привести к образованию активных форм кислорода (АФК). В научных работах показано, что увеличение выработки АФК, как из-за внутренних, так и из-за внешних факторов, может вызвать окислительный стресс, влекущий изменения в структуре и функции фосфолипидов и белков. В ядре АФК атакуют ДНК, вызывая её фрагментацию и активацию апоптоза, тем самым изменяя экспрессию генов и белков. Накопленные данные также свидетельствуют о том, что эндогенно продуцируемые АФК могут выступать в качестве вторичных посредников в регуляции клеточных сигнальных путей и в передаче сигналов, которые отвечают за регулирование самообновления и пролиферации спер-матогоний [10, 11, 12].

Ранее Аль Меселмани М.А. показал, что на эндогенных и экзогенных субстратах окислительные процессы воздействуют с поступлением разных количеств цезия ¹³⁷СS [2] .

Целью настоящего исследования является изучение воздействия эндогенных и экзогенных субстратов в кусочках ткани мужской репродуктивной системы в условиях внешнего радиационного облучения.

Методы и материалы

В исследовании были использованы беспородные белые крысы-самцы линии Wistar массой 220–240 г (n = 36). Крыс разделили на четыре группы, из которых одна группа – контрольная, а три остальные – подопытные. Количество крыс контрольной группы (9) облучению не подвергались. Крыс подопытных групп облучали дозой 1,0 Гр (мощности 0,92 Гр/мин) с помощью γ -установки «ИГУР-1» (Москва).

Для проведения анализа крыс трёх подгрупп выводили из эксперимента по истечении с момента облучения 3-х (группа 3сут), 10-ти (группа 10сут) и 40 (группа 40сут) суток соответственно.

Выделение семенников крыс проводили в среде Хенкса при t = 25 °C. Ткань измельчали, фильтровали, полученную суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Для расчёта количества клеток использовали камеру Горяева. Измерение содержания белка в пробах проводили биуретовым методом. После пермеабилизации клеточных мембран 0,005-процентным раствором дигитонина, для облегчения свободного поступления глутамата в клетки, для оценки параметров поглощения кислорода использовали полярографическую ячейку с закрытым платиновым электродом Кларка [13] .

Значения регистрировали в нмоль О 2 /мин на 1 мг белка исследуемой ткани или нмоль О 2 за 1 мин на 10⁷ клеток. Чувствительность метода позволяет определять концентрацию кислорода до 1 нМ/л. Измерения проводили в трёх повторах на каждую экспериментальную крысу.

Скорость дыхания ткани семенников оценивали на эндогенных субстратах (V энд ), а также и при добавлении в полярографическую ячейку 10 мМ глутамата натрия (V глу ). Рассчитывали коэффициент стимулирующего действия (СД) глутаминовой кислоты: СД глу = V глу /V энд .

Также определяли скорость потребления кислорода на экзогенных субстратах (10 ммоль сукцината,

V як ; 100 мкмоль 2,4-динитрофенола, V днф ). Рассчитывали величины стимулирующего действия янтарной кислоты (СД як = V як /V энд ; СД глу = V глу /V энд ) и 2,4-динитрофенола (СД днф = V днф /V глу ) [2, 14] .

Используя метод ингибиторного анализа, путём добавления в инкубационную среду (2,5 ммоль ами-тала натрия, V ам и 10 ммоль малоната натрия, V мал ), рассчитывали показатели амиталрезистентного дыхания – АРД = V ам /V энд и малонатрезистентного дыхания – МРД = V мал /V ам [2, 14] . Показатели АРД и МРД характеризовали интенсивность окисления флаво-протеидзависимых субстратов, позволяя оценить энергетический вклад жирных кислот (ЖК) [15] .

Статистическую обработку результатов выполнили с помощью программы «Statistica» 6.0 и Microsoft Excel 2021. Данные проверяли на нор- мальность распределения с использованием критерия хи-квадрата Пирсона. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

В ходе серии исследований установлено, что кусочки ткани мужской репродуктивной системы животных характеризуются высоким уровнем потребления кислорода (табл. 1, рис. 1).

Полученные данные о высоком потреблении кислорода в препаратах мужской репродуктивной системы подтверждаются литературными данными, о чём свидетельствуют уникальные характеристики метаболизма и биоэнергетики клеток семенников для поддержки своих функций, выработки сперматозоидов и секреции мужских гормонов [9] .

Таблица 1. Показатели поглощения кислорода в семенниках крыс после γ-облучения в дозе 1,0 Гр на 3-и, 10-е и 40-е сутки эксперимента Table 1. Oxygen uptake indicators in rat testes after γ -irradiation at a dose of 1.0 Gy on days 3, 10, and 40 of the experiment

Скорость поглощения кислорода

Параметр	Контрольная группа	Группа 3 сут, n = 9	%	Группа 10сут, (n = 9)	%	Группа 40сут, (n = 9)	%
V энд	3,19 ± 0,02	2,72 ± 0,07*	85,3	6,64 ± 0,12*	208,2	7,04 ± 2,76*	220,7
V як	5,32 ± 0,31	4,33 ± 0,26*	81,4	7,72 ± 0,24*	145,1	11,96 ± 6,68*	224,8
V глу	4,79 ± 0,29	4,27 ± 0,38	89,1	10,17 ± 0,28*	212,3	9,44 ± 2,24*	197,1
V днф	6,31 ± 0,16	5,01 ± 0,44*	79,4	11,81 ± 0,38*	187,2	12,43 ± 2,59*	150,6
CД як	1,66 ± 0,10	1,59 ± 0,16	95,8	1,23 ± 0,03*	74,1	1,47 ± 0,37*	88,5
СД глу	1,46 ± 0,09	1,39 ± 0,07	95,2	1,53 ± 0,08	104,8	1,21 ± 0,05***	82,9
СД днф	1,33 ± 0,08	1,29 ± 0,06	97,0	1,16 ± 0,01*	87,2	1,09 ± 0,04***	98,5

Примечание: достоверность различий по отношению к контрольной группе: * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001.

Из данных, приведённых в таблице 1, видно, что ткань мужской репродуктивной системы крыс отличалась высоким уровнем потребления кислорода и повышенной чувствительностью к воздействию γ -излучения в дозе 1.0 Гр.

По прошествии 3-х суток (группа 3сут) с момента облучения в дозе 1,0 Гр (мощность дозы 0,92 Гр/мин)

отмечалось достоверное снижение интенсивности потребления кислорода препаратами ткани мужской репродуктивной системы животных на эндогенных субстратах (Vэнд) c 3,19 ± 0,02 нмоль О2/мин/мг в контроле до 2,72 ± 0,07 (–14,7 %) (p < 0,05), в то время как на 10-е сутки, напротив, наблюдалось увеличение скорости дыхания до 6,64 ± 0,12 нмоль О2/мин/мг (108,2 %) (p < 0,05). На 3-и сутки также наблюдалось достоверное снижение скорости поглощения кислорода в присутствии субстрата сукцината (Vяк) с 5,32 ± 0,31 в контроле до 4,33 ± 0,26 нмоль О2/мин/мг, т.е. на 18,6 % (p < 0,05), которая на 10-е сутки превышала исходное значение на 45,1 % (p < 0,05), достигнув величины 7,72 ± 0,24 нмоль О2/мин/мг. Примерно такая же динамика скорости окисления прослеживалась в присутствии другого экзогенного субстрата – глутамата. Так, отмечалось снижение скорости потребления кислорода при использовании глутамата с 4,79 ± 0,29 в контроле до 4,27 ± 0,38 нмоль О2/мин/ мг белка, т.е. на 10,9 % (p < 0,05), к 3-м суткам наблюдения. А по истечении 10-х суток наблюдения ско- рость поглощения кислорода в присутствии глутамата составила 10,17 ± 0,28 (112 %) (p < 0,05) (табл. 1, рис. 1).

Рисунок 1. Показатели поглощения кислорода в ткани семенников в % по отношению к контролю после однократного γ -облучения (1,0 Гр). Примечание: достоверность различий по отношению к контрольной группе: * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001

Figure 1. Oxygen uptake indicators in testicular tissue as a percentage relative to the control after a single γ -irradiation (1.0 Gy). Note: Statistical significance compared to the control group: * – p < 0.05; ** – p < 0.01; *** – p < 0.001

В процессе оценки показателей стимулирующего действия сукцината (СД як ) и глутамата (СД глу ) было отмечено уменьшение СД як по прошествии 10-х суток после облучения. Так, уменьшение СД як на этот момент составило 1,23 ± 0,03 по сравнению с контрольным 1,66 ± 0,10 (–25,9 %) (p < 0,05). Не было обнаружено достоверных изменений показателя СД глу (табл. 1, рис. 2).

Следует отметить, что, с одной стороны, снижение СД як является свидетельством повышения содержания сукцината в митохондриях, но, с другой стороны, демонстрирует уменьшение доли участия сукцината в транспорте энергии к митохондриям ткани семенников [9 , 15] .

Анализы влияния специфических ингибиторов тканевого дыхания амитала натрия (V ам ) и малоната натрия (V мал ) на окислительные процессы в семенниках крыс представлен в таблице 2. Так, через 3-е суток после облучения скорости поглощения кислорода при V ам и V мал соответственно уменьшалась с 2,53 ± 0,34 и 2,15 ± 0,31 нмоль O 2 /мин/мг белка в контроле до 1,94 ± 0,03 и 1,15 ± 0,12 нмоль O 2 /мин/мг белка в опыте. Однако через 10 суток V ам и V мал достоверно возрастали до 6,37 ± 0,04 и 5,84 ± 0,23 нмоль O 2 /мин/мг белка, т.е. на 151 % (p < 0,05) и 171 % (p < 0,05) соответственно (табл. 2, рис. 3).

Таблица 2. Показатели поглощения кислорода при использовании амитала натрия и малоната натрия в семенниках крыс после γ-облучения в дозе 1,0 Гр на 3-и, 10-е и 40-е суткиэксперимента

Table 2. Oxygen uptake indicators with the use of sodium amytal and sodium malonate in rat testes after γ -irradiation at a dose of 1.0 Gy on days 3, 10, and 40 of the experiment

Параметр	Скорость поглощения кислорода
	Контрольная группа	Группа 3 сут, n = 9	Группа 10сут, (n = 9)	Группа 40сут, (n = 9)
Vэнд	3,34 ± 0,43	2,73 ± 0,19	7,21 ± 0,11**	6,86 ± 0,02*
Vам	2,53 ± 0,34	1,94 ± 0,03	6,37 ± 0,04*	4,52 ± 0,16*
Vмал	2,15 ± 0,31	1,15 ± 0,12*	5,84 ± 0,23*	3,15 ± 0,22*
АРД	0,77 ± 0,02	0,70 ± 0,03	0,88 ± 0,02*	0,68 ± 0,02*
МРД	0,85 ± 0,02	0,60 ± 0,04*	0,93 ± 0,02*	0,59 ± 0,07*

Рисунок 2. Величины стимулирующего действия янтарной кислоты и глутамата, а в ткани семенников в % по отношению к контролю после однократного γ -облучения (1,0 Гр)

Figure 2. The magnitude of the stimulatory effect of succinic acid and glutamate in testicular tissue as a percentage relative to the control after a single γ -irradiation (1.0 Gy)

Для описанной метаболической ситуации (рис. 4) нет оснований говорить об активации на 3-и сутки после облучения системы β -окисления жирных кислот, поскольку коэффициент малонатрезистентного дыхания (МРД) в подопытной группе животных к этому моменту достоверно снижался до 0,60 ± 0,04 по сравнению с 0,85 ± 0,02 в контроле.

Вместе с тем, спустя десять суток после облучения крыс в дозе 1,0 Гр показатель, характеризую-

Рисунок 3. Показатели поглощения кислорода в ткани семенников при влиянии ингибиторов после однократного γ -облучения (1,0 Гр)

Figure 3. Oxygen uptake indicators in testicular tissue under the influence of inhibitors after a single γ -irradiation (1.0 Gy)

щий МРД, демонстрировал тенденцию к росту до 0,93 ± 0,02 против 0,85 ± 0,02 в контроле (табл. 2, рис. 4). Последнее может быть истолковано в пользу увеличения чувствительности дыхательной цепи к действию высокоспецифического ингибитора СДГ малоната натрия.

Опыты, выполненные с добавлением разобщителя процессов окислительного фосфорилирования, подтвердили разнонаправленную динамику изменения функциональной активности потребления кислорода в образцах семенников крыс на 3-и и 10-е сутки. В частности, Vднф у крыс на 3-и сутки достоверно снижалась на 20,6 % (p < 0,05), а на 10-е – достоверно возросла на 87,2 % (p < 0,05) (табл. 1, рис. 5). Исходя из величины расчётного коэффициента СДднф после облучения в дозе 1,0 Гр на протяжении 3-х суток наблюдения не происходило разобщения дыхания и фосфоримерования в митохондриях семенников (табл. 1). Снижение СДднф с 1,33 ± 0,08 в контроле до 1,16 ± 0,01 (p < 0,05) в подопытной группе животных на 10-е сутки свидетельствовала о возможной лабилизации системы окислительного фосфорилирования митохондрий семенников.

В ходе опытов на 40-е сутки наблюдалось сохранение статистически значимо усиленного потребления кислорода в ткани семенников на эндогенных субстратах и возврат показателей скорости окисле- ния экзогенных субстратов (сукцината и глутамата) к исходным значениям. В частности, усиление поглощения кислорода в присутствии сукцината на 40-е сутки наблюдения составило 11,96 ± 6,68 нмоль O2/мин/мг белка против 5,32 ± 0,31 нмоль O2/мин/мг белка в контроле. В присутствии экзогенного субстрата глутамата скорость потребления кислорода возрастала с 4,79 ± 0,29 нмоль O2/мин/мг белка в контроле до 9,44 ± 2,24 нмоль O2/мин/мг белка (на 152 %) (p < 0,05) в подопытной группе. Эндогенное дыхание составило 7,04 ± 2,76 против 3,19 ± 0,02 нмоль O2/мин/мг белка в контроле (табл. 1, рис. 1). При оценке коэффициентов СДяк и СДглу отмечено их достоверное снижение. Так, величина СДглу на 40-е сутки составляла 1,21 ± 0,05 (p < 0,001) против 1,46 ± 0,09 в контроле, а величина CДяк составляла 1,47 ± 0,37(p < 0.05) против 1,66 ± 0,10 в контроле (табл. 1, рис. 2).

Рисунок 4. Показатели амиталрезистентного и малонатрезистент-ного дыхания в ткани семенников крыс после однократного γ -облучения (1,0 Гр)

Figure 4. Amytal-resistant and malonate-resistant respiration indicators in rat testicular tissue after a single γ -irradiation (1.0 Gy)

Рисунок 5. Влияние 2,4-ДНФ на поглощение кислорода в семенниках крыс в % по отношению к контролю после однократного γ -облучения (1,0 Гр)

Figure 5. The effect of 2,4-DNP on oxygen uptake in rat testes as a percentage relative to the control after a single γ -irradiation (1.0 Gy)

Данные о результатах ингибиторного анализа, выполненного через 40 суток после облучения животных, приведённые в таблице 2, с одной стороны, позволили обнаружить достоверное увеличение интенсивности процессов тканевого дыхания в семенниках после однократного γ -облучения (увеличение V ам и V мал ), что подтвердило феномен стимулирующего влияния радиации на работу митохондрий. С другой стороны, было отмечено снижение резервов жирных кислот в изученных препаратах, что проявлялось в достоверном уменьшении коэффициентов АРД и МРД соответственно с 0,77 ± 0,02 и 0,85 ± 0,02 в контроле до 0,68 ± 0,02 и 0,59 ± 0,07 в подопытной группе (p < 0,05) (рис. 4).

В соответствии с полученными данными, спустя 40 суток после облучения, происходило снижение показателя СД днф с 1,33 ± 0,08 (контроль) до

1,09 ± 0,02 (на11,5 %) (p < 0,001), что всё ещё позволяло констатировать присутствие разобщения в системе окисления и фосфорилирования (рис. 5).

Однако через 10 суток коэффициент CД як уменьшался на 25,9 % (p < 0,05) и, забегая вперёд, оставался достоверно сниженным вплоть до завершения эксперимента, т.е. до 40-х суток наблюдения. Интересно отметить, что CД глу после облучения животных в дозе 1,0 Гр практически не изменялся ни через 3, ни через 10 суток наблюдения (рис. 2).

Обсуждение

Как известно, процесс поглощения кислорода в митохондриях сперматозоидов разъясняет метаболическую картину и функциональное состояние мужской репродуктивной системы. Так, уменьшение или повышение потребления кислорода в тестику- лярных тканях приводит к нарушению энергетического баланса мужской половой системы и, соответственно, к изменению морфофункциональной характеристики семенников.

Окислительный стресс играет важную роль в развитии и прогрессировании метаболизма сперматозоидов. Митохондрии являются наиболее важными источниками активных форм кислорода в сперматозоидах [10, 11, 15]. Нарушения метаболизма субстратов в мужской репродуктивной системе вызывают адаптацию и дисфункцию митохондрий, проявляющихся в несоответствии между окислением жирных кислот в митохондриях и активностью цепи переноса электронов (ЭТЦ), что способствует выработке АФК в компонентах ЭТЦ. Кроме того, другие источники митохондриальных АФК, полученные как продукты метаболических путей, таких как β-окисление жирных кислот, также могут продуцировать значительное количество АФК с вовлечением их в метаболизм сперматозоида [12, 14, 15]. Повышенная выработка АФК сперматозоидами может вызывать различные эффекты, включая сбой программирования метаболизма энергетических субстратов в мужской репродуктивной системе, модуляцию метаболического воспаления, окислительно-восстановительную модификацию ионных каналов и транспортёров, а также апоптоз сперма- тозоидов, что, в конечном итоге, приводит к структурным и функциональным изменениям семенников [3, 12]. Основываясь на вышеуказанных механистических взглядах, в настоящем обзоре обобщено современное понимание механизмов, лежащих в основе метаболизма сперматозоидов с акцентом на роль окислительного стресса [10, 11, 12].

Заключение

Окислительные процессы в сперматозоидах чувствительны к внешнему γ -облучению при дозе 1,0 Гр. Воздействие однократного γ -облучения на показатели поглощения кислорода выражается в ингибирующем влиянии на 3-и сутки, которое сменяется стимулирующим действием на 10-е и 40-е сутки.

Выявлен эффект снижения потребления кислорода при окислении сукцината и глутамат натрия, а также в присутствии малоновой кислоты и 2,4-динитрофенола через 3-е суток после облучения крыс.

На 10-е сутки потребление кислорода увеличилось сперматозоидами в 2 раза в результате окисления эндогенных субстратов, сукцината натрия, глутамата натрия с сохранением этого эффекта в присутствии ингибиторов дыхания и 2,4-динитрофенола на протяжении 40-суточного наблюдения.