Совершенствование клонального микроразмножения крыжовника

( инициация ), этапов собственно размножения , укоренения и адаптации полученных растений к нестерильным условиям .

Целью настоящего являлась оптимизация процесса клонального микроразмножения крыжовника .

Методика исследования

Работа проводилась в Научно - образовательном центре биотехнологии Брянской ГСХА . Объектом исследования являлись сорта крыжовника : Северный капитан , Снежана , Асирома , Неслухнянский , Карпаты .

Заготовку черенков растений крыжовника осуществляли в октябре за несколько дней до изолирования эксплантов . Материал хранили в полиэтиленовых пакетах для предотвращения его подсыхания в холодильнике при температуре 4° С .

Перед изолированием эксплантов черенки нарезали на сегменты с одной почкой длинной 2-4 см , которые стерилизовали в 0,1% растворе мертиолята ( орто - этилртутьтиосалицилат натрия ) и 0,3% SDS ( додецилсульфат натрия ) в качестве поверхностно активного вещества в течение 3 минут на шейкере , с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде . В качестве источников эксплантов использовали почки без нескольких кроющих чешуй .

Культивирование эксплантов осуществляли на питательной среде Мурасиге - Скуга [2] в пробирках Флоринского .

На этапе введения в культуру in vitro в качестве источника цитокинина испытывали : производные пуринового рядя – 6- бензиламинопурин (6- БАП ), кинетин ( Кин ), изопентиладенин (2-iP) в концентрации 0,2; производные дифенилмочевины - N -(2- хлор -4- пиридил )- N - фенилмочевину (CPPU), мг / л и тидиазурон (TDZ) в концентрации 0,1 мг / л .

Размножение растений осуществляли на питательной среде МС обогащенной витаминно минеральным комплексом « Компливит » (2 г / л ) и 6- БАП (1 мг / л ). Ш тативы с пробирками помещали на стеллажи оборудованные лампами дневного света . Повторные субкультивирования проводили по мере образования новых побегов ( в среднем через 6 недель ).

Для получения более крупных микрочеренков , пригодных к укоренению , при последнем субкультивировании испытывали питательные среды с пониженной концентрацией 6- БАП – 0.2 мг / л в сочетании с гиббереллином ( ГК ) в концентрациях 0.2, 0.5 и 1 мг / л .

Укоренение растений осуществляли в минипарничках (пластиковые кассеты , вставленные в поддон и накрытые прозрачной крышкой) наполненные предварительно увлажненным готовым субстратом («Нестеровский») смешанным с крупнозернистым речным песком в соотношении 3: 1. Для стимуляции корнеобразования базальная часть микрочеренков обрабатывалась ауксинсодержащим препаратом «Корневин». По мере отрастания растений и появления новых листочков, крышку с минипарничка снимали. Периодически проводили полив и опрыскивание растений. Через 1.5-2 месяца окрепшие растения распикировывали в пластиковые ящики, выстланные нетканым материалом и заполненные субстратом. С наступлением положительных температур в весенний период ящики переносились в легкие теплицы, накрытые нетканым материалом типа Лутрасил для адаптации к ультрафиолетовому излучению.

Результаты и обсуждения

Крыжовник в сравнении с другими плодово ягодными культурами обладает низкой регенерационной способностью [3, 4].

На этапе введения в культуру in vitro в состав питательной среды вводят регуляторы роста цитокининовой природы . При культивировании первичных эксплантов крыжовника применяют 6- БАП в невысоких концентрациях (0,2-0,5 мг / л ) [5, 3, 6]. Положительным эффектом при введении ягодных растений в культуру in vitro обладают регуляторы роста цитокининовой природы ряда дифенилмочевины : тидиазурон и CPPU, которые увеличивали приживаемость эксплантов , количество регенерировавших побегов у ремонтантных форм малины и смородины чёрной [7, 8].

Лучшая приживаемость исходных эксплантов была отмечена на питательных средах со следующими регуляторами роста – 6- БАП , CPPU и тидиазурон ., Оптимальными показателями роста и развития отличались растения , культивируемые на среде CPPU, которые лидировали по способности регенерировать дополнительные почки , их количеству и высоте эксплантов ( табл . 1). Кинетин и 2-iP вызывали лишь распускание незначительной группы почек , без образования дополнительных побегов . В среднем отмечалась регенерация одной почки / побега на эксплант , за исключением варианта с CPPU.

Таблица 1 – Влияние регуляторов роста цитокининовой природы на эффективность введения в культуру in vitro крыжовника (сорт – Северный капитан)

№ п.п.	Регулятор роста растений , мг/л	Изолированно эксплантов	Количество эксплантов, образовавших почки, %	Почек на эксплант, шт.	Высота эксплантов, мм	Эксплантов с каллусом
1	6-БАП 0,2	54	40,1 ± 13,6	1,0 ± 0	4,6 ± 1,4	38,5 ± 7,8
2	СPPU 0,2	53	47,3 ± 6.2	1,3 ± 0,75	5,5 ± 1,3	70,9 ± 5,3
3	TDZ 0,1	50	26,8 ± 5,8	1,0 ± 0	4,8 ± 1,1	57,4 ±8,5
4	Кин 0,2	50	3,0 ± 5,3	1,0 ± 0	4,6 ± 1,3	0
5	2-iP 0,2	55	0	0	5,0 ± 0,9	0

Отличительной особенностью регуляторов роста ряда дифенилмочевины ( тидиазурон и CPPU) являлось образование каллуса в месте среза первичного экспланта . Однако при весеннем введении в культуру in vitro крыжовника сорта Северный капитан каллусообразования не наблюдалось . При проведении первого субкультивирования каллусы удалялись и их образования на среде размножения уже не происходило . Каллусы имели белесый цвет , рыхлую консистенцию , легко рассыпались при надавливании , т . е . не обладали морфогенными признаками и , следовательно , потенциальной возможностью появления сомаклональных вариантов при регенерации растений через каллусную культуру .

После месяца культивирования первичные экспланты существенно по высоте не отличались .

Для введения в культуру in vitro четырех сортов крыжовника использовали оптимизированный состав питательной среды МС с присутствием в ней CPPU в концентрации 0,2 мг / л .

Количество эксплантов регенерировавших дополнительные почки составило 30,2-58,3%. На одном экспланте образовывалось в среднем от 1,2 ( сорт Карпаты ) до 1,7 дополнительных почек ( сорт Неслуховский ), но этот показатель не превышал 3. Высота эксплантов также существенно не отличалась по сортам и варьировала в диапазоне 4,1-5,7 мм ( табл . 2).

Таблица 2 – Особенности введения в культуру in vitro крыжовника (CPPU 0,2 мг/л)

№ п.п.	Сорт	Изолированно эксплантов, шт.	Частота контаминации, %	Количество эксплантов, образовавших почки, %	Почек на эксплант, шт.	Высота эксплантов, мм
1	Снежана	78	44,9	33,3 ± 16,7	1,5 ± 0,6	4,1 ± 1.7
2	Асирома	82	75,6	38,9 ± 24,1	1,3 ± 0,5	5,7 ± 1,0
3	Неслуховский	56	75,0	58,3 ± 14,4	1,7 ± 0,7	4,8 ± 0,6
4	Карпаты	40	62,5	30,2 ± 16,5	1,2 ± 0,5	4,4 ± 1,1

Таким образом , удалось успешно ввести в культуру пять сортов крыжовника , которые в дальнейшем подверглись черенкованию в условиях in vitro . Оптимальным регулятором роста был CPPU в концентрации 0,2 мг / л .

В качестве источника цитокинина в питательной среде на этапе размножения крыжовника используют 6- БАП в различных концентрациях в сочетании с ИМК или без него ( Приходько , 1996).

В наших исследованиях при размножении растений крыжовника на средах с концентрацией 6- БАП 1 мг / л образовывались небольшие ( менее 1 см ) конгломераты со средним коэффициентом размножения 3,4. Новые побеги образовывались относительно быстро – спустя 3 недели , что давало возможность при среднем коэффициенте размножения в короткий срок размножить изучаемый материал .

Установлено , что лучшей укореняемостью в культуре in vitro обладают крупные побеги ( Высоцкий , 1998). Малый размер побегов крыжовника затрудняет последующий этап клонального микроразмножения ( укоренение ), что потребовало включения дополнительного этапа элонгации .

Предварительный эксперимент по элонгации побегов показал , что безгормональная среда , применяемая на малине в нашей лаборатории , на крыжовнике оказалась неэффективной – некоторая часть растений в условиях in vitro погибла , а их вытягивание было несущественным . Введение в состав среды витаминно - минерального комплекса « Компливит » в концентрации 2 г / л в сочетании с низкой концентрацией 6- БАП (0,2 мг / л ) вызывало формирование более крупных побегов . Эффективность низких концентраций 6- БАП на последнем этапе культивирования крыжовника подтверждается также и другими авторами ( Приходько , 1996).

Фитогормоном , отвечающим за растяжение клеток и междоузлий растений , является гиббереллин ( ГК ), который рекомендуют вводить на этапе размножения в низких концентрациях . Для удлинения побегов нами был заложен эксперимент с различными концентрациями ГК в сочетании с 6- БАП в концентрации 0,2 мг / л . Результаты этого опыта представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Влияние 6-бензиламинопурина и гибберелловой кислоты на элонгацию побегов крыжовника in vitro (Северный капитан)

№ п.п.	Вариант	Высота побегов, мм		Приживаемость, %
		M±m	%
1	Безгормональная среда (контроль)	5,3 ± 1,8	100,0	24,1
2	6-БАП 0,2 мг/л	6,8 ± 1,7	128,3	82,6
3	6-БАП 0,2 мг/л + ГК 0,2 мг/л	7,0 ± 2,1	132,1	75,0
4	6-БАП 0,2 мг/л + ГК 0,5 мг/л	8,8 ± 2,3	166,0	63,3
5	6-БАП 0,2 мг/л + ГК 1 мг/л	10,7 ± 3,4	201,1	67,7

В контрольном варианте на безгормональной среде высота побегов крыжовника сорта Северный капитан не увеличилась в сравнении с аналогичным показателем на этапе размножения и , кроме того , культивируемые микрочеренки обладали низким показателем приживаемости (24,1%). Оставшиеся к учетному периоду растения не ветвились и имели желтоватую окраску листьев .

Сохранность растений на среде с низкой концентрацией 6- БАП увеличилась более чем в три раза , и кроме того наблюдалась тенденция образования более крупных побегов . В отличие от контроля растения образовывали дополнительные побеги .

Включение в состав питательной среды гиббереллина вызвало увеличение длины побегов за счет растяжения междоузлий по мере возрастания концентрации регулятора роста от 0,2 до 1 мг / л .

Большинство ягодных растений при размножении на питательных средах в присутствии с цитокининами не имеют корней , поэтому , как правило , третьим этапом клонального микроразмножения является укоренение полученных микрочеренков in vitro . Индукция корнеобразования достигается за счет введения в состав ауксинов или замачиванием черенков в ауксинсодержащих растворах с последующим культивированием на безгормональной среде . Частота укоренения и качество образовавшихся корней в первую очередь зависят от генотипа .

Существенным преимуществом перед названными способами индуцирования ризогенеза обладает укоренение растений непосредственно в грунт с предварительной обработкой базальной части концентрированным раствором ауксина . В этом случае увеличивается частота укоренения растений , образовавшиеся корешки непосредственно адаптируются к нестерильным условиям грунта и не повреждаются , как в случае с высадкой укорененных in vitro растений .

При обработке неукорененных микрочеренков крыжовника препаратом « Корневин » и высадкой в субстрат , приживаемость растений составила около 100%.

Однако в отличие от других ягодных культур крыжовник отличался самыми низкими приростами . Через 2 месяца после высадки высота растений не превышала 4-5 см , тогда как по нашим наблюдениям , растения смородины черной и малины к этому времени достигают 10-20 см . По - видимому , такая особенность роста ювенильного материала полученного in vitro соответствует ростовым характеристикам сеянцев крыжовника , которые очень медленно прорастают и продолжительное время находятся в состоянии миниатюрных проростков .

Выводы

• 1.    Увеличение приживаемости и регенерации побегов крыжовника в культуре in vitro достигается за счет введения в состав питательной среды CPPU в концентрации 0,2 мг / л ;

• 2.    Увеличение высоты побегов достигается при введении в состав среды ГК в концентрации 0,5-1 мг / л ;

• 3.    Микрочеренки крыжовника эффективно укореняются непосредственно в нестерильном торфяном грунте при обработке базальной части побегов ауксинсодержащим препаратом « Корневин ».