Современные методы фиксации биологического материала для образовательных целей

Сохранение биологического материала в настоящее время является актуальной проблемой для всех медицинских и образовательных учреждений в Российской Федерации. Несмотря на длительную историю консервации биологического материала, постоянный поиск новых методик не прекращается и в настоящее время для выявления более безопасных методов с сохранением морфологических свойств для дальнейшего изучения материала и использования его в образовательных целях.

В настоящее время самым распространённым методом фиксации биологического материала является применение десятипроцентного водного раствора формальдегида, который достаточно агрессивно взаимодействует с биологическим материалом, изменяя его морфологические свойства и ДНК в тканях [1], а также обладает раздражающим действием на слизистые оболочки исследователя и является достаточно токсичным веществом при длительном взаимодействии.

Ранее для консервации трупов использовался метод консервации насыщенным солевым раствором по Амбруаз Паре (1510–1590), состоящий из хлорида натрия, 20% формальдегида, фенола, глицерина, изопропилового спирта и воды, который до сих пор часто применяется для изготовления музейных препаратов.

Относительно новый метод «мягкой» фиксации трупного материала методом Тиля (фиксация материала в растворе этиленгликоля, 4-хлор-3-метилфенола, борной кислоты, нитрата калия и нитрата аммония с дальнейшим погружением в раствор 3% борной кислоты, 10% моноэтиленгликоля, 10% нитрата аммония, 5% нитрата калия, 7% сульфита натрия и 2% формалина на срок до 6-ти месяцев) достаточно эффективен в практике, но критикуется за сложность исполнения и высокую цену методики [2].

Цель работы – поиск литературных данных о новых консервирующих растворах, применяемых в современных условиях для фиксации трупного биологического материала для образовательных целей.

Материалы и методы

Для достижения поставленной цели был проведён научный поиск по базе РИНЦ и PubMed за последние 5 лет с дополнительным изучением постатейных ссылок по следующим ключевым словам:

• -    по базе РИНЦ: (консервация или бальзамирование) and (труп) по тематике «Медицина и здравоохранение» и «Биология» – было получено 27 результатов;

• -    по базе PubMed: ((conservation) OR (embalming)) AND (cadaver) – было получено 695 результатов.

Критерии включения:

• -    статьи и патенты на русском и английском языках;

• -    оригинальные исследования;

• -    практические наблюдения метода бальзамирования.

Критерии исключения:

• -    обзорные статьи;

• -    методики пластинации биологического материала и создания 3D-моделей;

• -    статьи с обсуждением проблем получения биологического материала для научной и образовательной деятельности, правовых основ консервации биологического материала.

В итоге в обзор попали 9 статей.

Результаты

В 2019 году Рыковой Д.Г. с соавт. был предложен метод консервации биологических тканей с использованием диальдегида, что обеспечивало увеличение сроков хранения органов любых размеров, а также позволяло сохранить цвет и органолептические свойства мягких тканей препаратов [3]. Способ фиксации и хранения биоматериала включает промывание водой биоматериала с последующей фиксацией его путём полного погружения в 10% водный раствор диальдегида по объёму, превышающему объём биоматериала не менее чем в 10 раз, с заменой реагента на 7, 14 и 21 сутки, каждый раз промывая биоматериал после удаления реагента проточной водой. На 14-е сутки производят замену реагента, имеющего следующий состав исходных компонентов (мас.%): диальдегид – 24,97%, дистиллированная вода – 74,93%, эозин K – 0,0032%, кар-боксиметилцеллюлоза – 0,0968%, с выдержкой последнего в растворе диальдегида не менее 12 часов. На 21-е сутки производят замену реагента, имеющего следующий состав исходных компонентов (мас.%): диальдегид – 24,271%, дистиллированная вода – 72,813%, эозин K – 0,0031%, глицерин – 2,9129%.

В 2019 году Абрамов А.А. предложил способ криоконсервации головного мозга трупа путём введения перфузии перфузата в верхний сагиттальный синус с дальнейшей возможностью изучения вещества головного мозга при образовательном процессе и в судебно-медицинской экспертизе [4]. Способ перфузии для криоконсервации головного мозга включает введение в головной мозг перфузата с последующим его удалением по двум раздельным каналам. В качестве охлаждающего канала выбран путь «сагиттальный синус –яремная вена» с входом в передний отдел сагиттального синуса. В качестве пропитывающего канала выбран путь «желудочки – шейные артерии и вены» с входом в желудочковые отделы головного мозга. Предлагаемый способ перфузии для криоконсервации головного мозга за счёт пропускания охлаждающего перфузата через крупнокалиберные сосуды головы обеспечивает повышение скорости охлаждения мозговых тканей, а за счёт перфузии через ликворную систему с распределённой топологией – равномерную пропитку межклеточного пространства головного мозга криопротектором и устраняет проблему закупоривания путей его протекания.

В 2023 году была опубликована работа Алябьева Ф.В. с соавт. об использовании раствора «Альдофикс» для фиксации свежих макропрепаратов [5]. Биологический объект, изъятый после вскрытия трупа, промывали водой, после чего помещали в контейнер с раствором «Альдофикса», превышающим объём органа не менее чем в 10 раз. Состояние органа оценивалось сразу при помещении в раствор, через 7 дней, 1, 3 и 5 месяцев. По виду, по сравнению с исходным, макропрепараты были качественными, сохранились внешне и напоминали свежие, нефиксированные органы. Патентованный раствор «Альдофикс» выполнен на основе водного раствора глиоксаля с применением стабилизирующих веществ.

В 2020 году Воробиевской С.В. и соавт. был предложен новый метод изготовления мягких анатомических препаратов, который включает предварительное придание демонстрационной формы препарату, фиксацию препарата при температуре не выше +5 °С в растворе, содержащем формалин – 60 г, уксуснокислый натрий – 100 г, хлористый калий – 10 г, воду дистиллированную – 1000 г, при этом объём раствора в 3 раза превышает объём фиксируемого препарата. В этом растворе препарат выдерживают пока ткани равномерно уплотнятся и кровь перестанет экстрагироваться в раствор, что занимает от нескольких часов до 1 месяца, в зависимости от размера, плотности и строения органа. Раствор заменяют на новый 1 раз в 5 дней, затем проводят восстановление цвета в 95% спирте, с экспозицией от нескольких минут до 3 часов, в зависимости от плотности, размера и строения органа. Далее проводят консервацию в растворе, содержащем глицерина – 3800 г, уксуснокислого натрия – 30 г, воды – 1000 г, тимола – 10 г, при этом раствор должен полностью покрывать препарат. Экспозиция на данном этапе составляет от 2 до 4 месяцев. С помощью предложенного метода возможно изготавливать анатомические препараты, которые нетоксичны, лишены запаха, обладают высокой наглядностью и близки к естественной окраске и форме органов и тканей, что позволяет изучать их не только визуально, но и мануально, и хранить на открытом воздухе без использования герметично закрытых контейнеров [6].

Для лапароскопических гинекологических тренингов был разработан способ консервирования тел доноров на основе модификации старой методики с применением раствора, содержащего 70% этанола, 30% глицерина и дополненных лизофор-мином 0,3 объёмных процента. Лизоформин (Lysoform, Dr. Hans Rosemann GmbH, Германия) – дезинфицирующее средство, содержащее 6% формальдегида, 1,8% глутарала, 5% алкилэфирсульфата, 5% этанола и 5% анионных поверхностно-активных веществ. Раствор вводился внутрисосудисто. Дальнейшее хранение консервированных тел осуществлялось заворачиванием в салфетки с консервирующим раствором объёмом, содержащим около 1–2 л тимол в качестве консервирующего агента и с добавлением 1 литра этанола с дальнейшим разбавлением до 10 л воды. Труп далее упаковывался в полиэтилен для обеспечения влажности камеры хранения и находился в запечатанном пластиковом пакете при температуре +4 ºС до одного года, при этом неоднократно использовался для манипуляций [7].

Предложен новый метод фиксации биологического материала раствором на основе феноксиэтанола (техника Кросадо). Этот раствор применялся в основном для фиксирования тканей трупов для обучения в университете морфологическим дисциплинам [8]. Особенность раствора заключается в том, что формальдегид в нём используется в минимальной концентрации. Был разработан протокол бальзамирования с использованием феноксиэтанола в концентрации 7 и 1,5 об.% в фиксаторе и консерва-ционной жидкости соответственно. Метод феноксиэтанола обеспечивает эстетичные, прочные и не имеющие запаха ткани. Отбеливание менее выражено по сравнению с протоколами на основе этанола или формальдегида. Ткани остаются гибкими после бальзамирования на основе феноксиэтанола и в некоторой степени могут быть использованы для биомеханических экспериментов. Сам раствор помогает зафиксировать ткани в классическом виде с сохранением естественного цвета с появлением небольшой желтизны. При этом раствор относительно дешёвый в использовании, но дороже водного раствора формальдегида.

В 2019 году описан метод бальзамирования с применением N-винил-2-пирролидона при эндоскопическом трансназальном доступе к основанию черепа, выполненном на кадаверном материале. Фиксация раствором была произведена внутрисосудисто в концентрации 10%. После фиксации мягкие ткани сохраняли эластичность, а сосуды составили реальную картину операции. Недостатком этого метода посчитали, что фиксация главного мозга была недостаточной – он оставался относительно мягким и был неподдающимся для дальнейшего исследования. При этом, при повышении концен- трации фиксирующего раствора уплотнялась слизистая оболочка и другие эпителиальные ткани, что затрудняло дальнейшие исследования. Тем не менее, положительной стороной метода являлось то, что для применения данного раствора не требовались какие-либо дополнительные условия в виде морозильных и вентиляционных камер, а также относительная дешевизна метода [9].

В статье 2021 года авторы описывают метод фиксации кадаверного материала без использования формальдегида раствором, содержащим этиловый спирт (25%), полиэтиленгликоль ПЭГ400 (20%), хлороксиленол (0,1%) и нитрат натрия (10%) с добавлением водопроводной воды, введённым внутриартериально. Последующее хранение материала осуществлялось в холодильной камере при температуре +4 ºС. Забальзамированные экземпляры по цвету, консистенции, микробиологическому составу почти в точности напоминали своих живых аналогов [10].

Заслуживает отдельного упоминания работа 2022 года Shun Otsuka с соавт., описывающими уменьшение уплотнения мягких тканей и запаха у трупа, фиксированного водным раствором формальдегида, после перфузии водным раствором мочевины [11]. Десять трупов были бальзамированы с использованием 12 л раствора формалина (6,75% формальдегида), глицерина, solmix AP-7 (85,5% этанола, 9,6% н-пропилового спирта, 4,9% изопропилового спирта, 0,2% воды) и воды через дорсальные артерии стопы и радиальные артерии. После фиксации трупы помещали в резервуаре с 60–70%-м этанолом на 2–4 недели, а затем консервировали в запечатанном полиэтиленовом пакете и хранили при комнатной температуре. Перед обучением хирургическим навыкам (за 2–7 дней до тренировочного вскрытия) 4 из 10 трупов реперфузировали 8–15 л водного раствора, насыщенного мочевиной (1 кг кристаллов мочевины на 1 л воды) через бедренные артерии с помощью механического насоса. После такой манипуляции курсанты и объективные механические тесты отмечали сходство фиксированных тканей с живой.

Заключение

В настоящее время разработаны отдельные современные методы фиксации биологического материала для образовательных целей, включающие в себя растворы, как содержащие формальдегид, так и без его использования. Современная тенденция определяется в снижении количества используемого формальдегида в таких растворах или удалении его из тканей перед образовательным процессом.

Современные методики консервации зарекомендовали себя с хорошей стороны, позволяя добиться реалистичности биологических тканей, но всегда дороже стандартной методики фиксации с использованием водного раствора формальдегида за счёт стоимости самого раствора или оборудования.