Современные подходы генной терапии к лечению сахарного диабета

Сахарный диабет (далее СД) представляет собой хроническое заболевание с устойчиво высоким уровнем глюкозы в крови по причине недостаточной выработки инсулина или из-за того, что организм не может использовать инсулин при его выработке, в то время как инсулин играет важную роль в поддержании метаболического гомеостаза организма. Основной причиной диабета 1 и 2 типов является аутоиммунная гибель бета-клеток поджелудочной железы [1], где происходит экспрессия инсулина различными комбинациями транскрипционных факторов. По подсчетам Международной диабетической федерации (IDF) в 2021 году диабетом страдают более 10,5% мирового населения, а распространенность СД ожидается к увеличению на 11,3% к 2030 году, что ляжет тяжелым бременем на развитие экономики из-за увеличения расходов на здравоохранение. К ключевым факторам, способствующим увеличению численности заболевших диабетом, являются: урбанизация, старение, уменьшение степени физической активности, рост распространенности избыточного веса и ожирения [2]. Клеточная терапия, основанная на трансплантации донорских клеток, видится многообещающей, однако нехватка донорского материала является сдерживающим фактором для развития подобных технологий. Еще одним перспективным походом в лечении диабета является дифференцировка эмбриональных стволовых клеток, но соответствующие протоколы находятся в разработке. Современные подходы генной терапии, как вирусные, так и невирусные, стали перспективными для лечения диабета, многие исследования подтверждают ее эффективность. Перенос генов можно разделить на перенос in vivo и in vitro. Для успешной доставки in vivo носитель трансгена должен быть соответ- ствующим образом направлен к клеткам-мишеням, а генный продукт должен быть защищен от иммунной атаки. Генетическое манипулирование клетками in vitro менее инвазивно, чем методы in vivo, однако клетки-мишени должны легко удаляться и трансплантироваться обратно хозяину [3].

Технология CRISPR/Cas9

Одним из перспективных подходов для лечения диабета являются технологии редактирования генов с применением кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами (CRISPR/Cas9). Существует много подходов реализации данной системы, однако этот метод относительно новый и доказательства его эффективности отсутствуют. Система CRISPR/Cas9 представляет собой две ключевые молекулы – гидовую РНК (далее гРНК), которая дает направление комплексу в требуемый участок генома, и эндонуклеаза CAS9, которая осуществляет двухцепочечный разрез ДНК. Комплекс находит в геноме целевой участок, связывается и раскручивает двухцепочечную спираль, а комплементарная последовательность гРНК связывается с одной из цепей. Эндонуклеазные доменты CAS9 при эффективном связывании расщепляют обе цепи ДНК. После разрезания ДНК в клетке запускается механизм репарации. При гомологичной рекомбинации осуществляется вставка необходимой исследователю последовательности ДНК, а систему легко адаптировать под любую мишень просто изменив гРНК, CAS9 остается без изменений. При негомологичном соединении концов с образованием вставок или делеций некоторого числа нуклеотидов может быть реализована неправильная работа функциональных элементов генома.

В работе Alzhanuly B. и др. (2021) в системе CRISPR/Cas9 применили гидовую РНК для активации транскрипции инсулина, используя клеточную линию HEK293. При этом CAS9 связался с транскрипционными факторами VP64 и KRAB, регулирующими экспрессию гена INS. Удалось успешно активировать экспрессию таргет-ного гена, что было зафиксировано с по- мощью количественной полимеразной цепной реакции [5]. В других исследованиях есть работы по получению различных типов РНК, нацеленных на ген UCP1 и системы CRISPR-SAM, примененные к преадипоцитам человека. Результаты показали увеличение экспрессии гена UCP1, а мыши с ожирением, у которых развились человеческие коричневые адипоциты, показали устойчивое улучшение толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину. Кроме этого, известны исследования, нацеленные на ген FABP4 в белых адипоцитах, который участвует в подавлении ожирения, снижения массы тела и улучшения метаболических показателей организма с высокой степенью ожирения. В дополнении, чувствительность к инсулину значительно улучшилась.

По современным данным, система CRISPR/Cas9 может эффективно воздействовать на любой ген в любом организме, и исследования по лечению СД на мышах продемонстрировали, что можно изменить диабетический статус путем специфического воздействия на гены. Основная сложность использования технологии CRISPR/Cas9 заключается в доставке системы к месту назначения. Вариант вирусной доставки является основным методом, однако существует вероятность тяжелой иммуногенности. В связи с этим активно ведутся работы по совершенствованию системы адресной доставки [6].

Системы доставки генетического материала

Недавние исследования по достижению совместной экспрессии генов инсулина и глюкокиназы в скелетных мышцах показали успешные результаты внедрения методов манипуляции с генами при использовании векторов аденоассоциированного вируса (AAV-векторы), посредством которых была продемонстрирована долгосрочная эффективность в достижении нормог-ликемии без необходимости использования экзогенного инсулина. AAV-векторы имеют положительные характеристики в генной терапии, включая минимальный иммунный ответ и инфекционность, как в делящихся клетках, так и в спящих. Со- гласно проведенным исследованиям, мышам с СД вводили AAV-векторы содержащие гены инсулина и глюкокиназы при одновременной экспрессии которых белок-переносчик глюкозы GLUT4 и фер- менты глюкокиназы транслоцируются в модифицированные мышечные клетки, увеличивая поглощение глюкозы. В результате экспрессии фермента глюкокиназы облегчалось фосфорилирование глюкозы и регулировалась выработка инсулина, приводя к нормогликемии [7].

В работе Hou W.R. и др. (2011) была создана невирусная плазмида pBudCE4.1, содержащая гены проинсулина PI и реге-нирирующего белка поджелудочной железы Reg III. В результате введения данного комплекса, эффективно улучшилось состояние при СД, способствуя регенерации бета-клеток и индуцируя иммунологическую аутотолерантность [8].

В исследовании Anguela X.M. и др. (2013) в лечении СД использовалась плазмида pVAX, что позволило обеспечить временную экспрессию генов-мишеней как в паренхиматозных, так и в непаренхиматозных клетках печени. Был успешно экспрессирован ген инсулиноподобного фактора роста IGF-1. После десяти введе- ний, мыши достигали пролонгированного терапевтического эффекта без необходимости в дальнейшем лечении [9].

Заключение

Благодаря быстро развивающимся био- технологиям и завершенному проекту «Геном человека», генная терапия является одной из самых многообещающих технологий нового поколения. Однако у данной технологии существует ряд ограничений, связанных с самой природой системы доставки генов: вирусный вектор для генной терапии должен безопасно доставлять генетический материал, способен воздействовать на целевой участок ДНК и обеспечить адекватную экспрессию трансгена в течение необходимого периода времени. И хотя доказана эффективность нацеливания на клетки и экспрессии генов вирусных векторов, имеются некоторые сомнения в их безопасности при случайной интеграции вируса в геном хозяина. В тоже время, невирусные векторные системы имеют недостатки в эффективности трансдукции и отсутствии клеточной специфичности. Таким образом, на данный момент времени для внедрения генной терапии в клиническую практику требуются дополнительные научные исследования.