Создание генетически маркированных линий кукурузы с наследуемым и индуцированным типами партеногенеза

Явление гаплоидии, или образование особей с гаметическим (гаплоидным) набором хромосом, может использоваться для решения различных теоретических и практических задач, в том числе для изучения наследования количественных признаков, ускоренного создания гомозиготных линий, необходимых для производства высокогетерозисных гибридов [1-4]. Однако в норме частота образования гаплоидов является крайне низкой, в среднем 1/1000 [5]. В связи с этим особый интерес представляют растения, у которых партеногенез проявляется стабильно из поколения в поколение с относительно высокой частотой, и, так называемые гаплоиндукторы – растения, использование которых в качестве опылителей стимулирует партеногенетическое развитие зародышей у материнских форм [6]. В обоих случаях развитие зародышей из неоплодотворенной яйцеклетки с редуцированным числом хромосом приводит к образованию гаплоидов материнского типа, т.е. матроклинных гаплоидов [7]. Вследствие того, что матроклинная гаплоидия может определяться разными генетическими причинами, В.С. Тырновым с коллегами [8] была обоснована концепция о наследуемых и ненаследуемых (индуцированных) формах гаплоидии. Наследуемые формы могут служить материалом для создания линий с диплоидным (нередуцированным) апомиксисом, ненас-ледуемые (индуцированные) формы гаплоидии – для получения амфимиктичных линий, поскольку возникновение у них гаплоидов в поле может значительно снизить урожайность [8].

Несмотря на то, что для целого ряда культурных растений разработаны достаточно эффективные технологии получения гаплоидов [1], частота их образования в потомстве все еще остается лежащей в пределах нескольких процентов. В силу этого отбор гаплоидных растений в потомстве всегда сопряжен с анализом большого количества особей. Для повышения

эффективности данного этапа селекционно-генетических работ необходимы быстрые и простые методы диагностики плоидности, позволяющие в полевых и лабораторных условиях выявлять гаплоиды на разных стадиях развития: среди сухих семян, проростков и взрослых растений. Одним из таких методов является генетическое маркирование, впервые предложенное S.S. Chase в 1949 г. для кукурузы [9]. В основе метода лежит использование в скрещиваниях линий гомозиготных по аллеломорфным генам. Гибридное потомство от таких скрещиваний имеет доминантные признаки, тогда как матроклинные гаплоиды – рецессивные. Все зерновки и проростки с доминантными признаками выбраковываются, как возникшие в результате оплодотворения; немаркированные доминантными признаками – отбираются, как предполагаемые гаплоиды для дальнейших исследований. В последствие метод генетического маркирования был использован для создания у кукурузы целого ряда линий-гаплоиндук-торов [10-14]. В результате многолетней работы сотрудниками Саратовского государственного университета были созданы линии, обладающие высокой гап-лоиндуцирующей способностью (КМС, ЗМС-8 и др.) и линии, склонные к наследуемому партеногенезу (АТ-1, АТ-3) [10, 15, 16].

Цель работы: создание новых универсальных генетически маркированных линий кукурузы (гапло-индуцирующих и партеногенетических) для получения матроклинных гаплоидов с высокими частотами.

Материалы и методы. Для создания новых генетически маркированных линий кукурузы с наследуемой и ненаследуемой (индуцированной) формами матроклинной гаплоидии были использованы линия Тестер Мангельсдорфа [17] и линии, ранее полученные в Саратовском государственном университете: АТ-1, характеризующаяся высокой частотой партеногенеза; ЗМС-8 и КМС, характеризующиеся высокой гаплоин-дуцирующей способностью. Растения выращивали в открытом грунте. Женские соцветия изолировали бумажными пакетами до появления первых пестичных нитей. Через 5-6 суток соцветия опыляли собранной с отцовских растений пыльцой.

Тестирование полученных линий на способность к партеногенезу или гаплоиндукцию проводили путем анализа частоты проявления гаплоидов в потомстве.

Гаплоиды выявляли методом генетического маркирования на сухих зерновках и проростках и морфометрическим методом на проростках [18]. Плоидность растений подтверждали, используя метод подсчета хромосом на временных давленых препаратах кончиков корешков, фиксированных в ацетоалкоголе (3:1) и окрашенных ацетокармином [19]. Часть соцветий фиксировали ацетоалкоголем на стадии зрелых зародышевых мешков для дальнейшего цитоэмбриологического анализа. Состояние женской генеративной сферы исследовали на препаратах, приготовленных методом ферментативной мацерации семязачатков с их последующей диссекцией [20]. Анализ препаратов проводили с помощью микроскопа «AxioStar Plus»(C.Zeiss, Германия).

Результаты исследования.

Создание генетически маркированных партеногенетических линий кукурузы. Ранее полученная в Саратовском госуниверситете линия АТ-1 характеризуется высокой частотой гаплоидного партеногенеза (до 82,6%) [16]. Однако растения этой линии не несут ярко выраженных маркерных признаков, контролируемых рецессивными генами, которые могли бы позволить легко идентифицировать гаплоидные растения в потомстве при опылении их пыльцой форм с доминантными аллеломорфными генами. Кроме того, линия трудно размножалась, поскольку при посеве в поле возникали главным образом гаплоиды. Единичные диплоиды имели низкую озерненность из-за сильной задержки опыления, вызванной резко выраженной протогинией [21]. Исследование линии АТ-1 и гибридов с ее участием (прямых и реципрокных) показали, что генетическая система, контролирующая партеногенез, может передаваться как посредством мужских, так и женских гамет, и экспрессироваться в различных генетических средах [15]. Партеногенез проявляется у гибридов F1 линии АТ-1 с обычными непартеногенетическими линиями [15, 22]. Выявленная закономерность открыла возможность создания на основе данной линии генетически маркированных линий с наследуемой формой гаплоидии. Так как число известных доноров партеногенеза у кукурузы ограничено, то для проведения селекционно-генетических работ расширение их коллекции представляется довольно важным. Получение новых генетически маркированных партеногенетических линий позволит упростить передачу генов партеногенеза в другие линии, контролировать гомо- и гетерозиготность апомиктов, автономное или половое происхождение эндосперма.

Для создания генетически маркированных линий мы использовали линию АТ-1 в качестве материнского родителя, который опыляли пыльцой растений линии Тестер Мангельсдорфа [17], имеющей хорошо выраженные фенотипические признаки, контролируемые рецессивными генами, локализованными во всех десяти хромосомах:

bm 2 – brown midrib (коричневая средняя жилка листа) – (1 хромосома);

lg 1 – liguleless leaf (безлигульный лист) – (2 хромосома); a 1 – anthocyaninless (отсутствие антоциановой окраски) – (3 хромосома);

su 1 – sugary endosperm (сахарный эндосперм) – (4 хромосома);

pr – red allerone (красный алейрон) – (5 хромосома); y 1 – yellow endosperm (желтый эндосперм) – (6 хромосома);

gl 1 – glossy seedling (глянцевые всходы) – (7 хромосома);

j 1 – japonica (белая полосатость листьев) – (8 хромосома);

wx – waxy endosperms (восковидный эндосперм) – (9 хромосома) ;

g 1 – golden (золотистая окраска листьев и стеблей) – (10 хромосома) [17].

Полученные гибриды F1 самоопылили, и в F2 проводили отбор растений, гомозиготных по различным генам, полученным от Тестера Мангельсдорфа. Данные растения тестировали на способность к партеногенезу путем анализа частоты появления гаплоидов и полиэмбрионов в их потомстве. Для обнаружения гаплоидов и полиэмбрионов зерновки проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге от 1500 до 3000 зерновок от каждого варианта. В течение нескольких последующих лет проводили отбор форм, с хорошо выявляемыми маркерными признаками, в которых с высокой частотой встречались гаплоиды и полиэмбрионы. В результате были отобраны варианты, имеющие легко выявляемые маркерные признаки (белые зерновки, коричневая средняя жилка листа, листья без лигулы, восковидный эндосперм, сахарный эндосперм и т.д.). Этим вариантам было присвоено обозначение АТТМ с указанием в скобках рецессивных маркерных генов, присутствующих в данном варианте в гомозиготном состоянии, например: АТТМ ( y 1 , lg 1 ) , АТТМ ( y 1, g 1 ) и т. д. У части вариантов были отмечены полиэмбрионные проростки и гаплоиды. Число гаплоидов в свободноопыленном потомстве этих вариантов варьировало от 0,34 до 1,3%, частота встречаемости полиэмбрионных проростков от 0 до 1,02%. Из полученных вариантов было отобрано два варианта с маркерными генами и наиболее высокой частотой гаплоидов в потомстве: АТТМ ( y 1, bm 2 ) и АТТМ ( y 1, bm 2, lg 1 ).

Цитоэмбриологический анализ состояния женской генеративной сферы изолированных соцветий, зафиксированных на 5-6 сутки после появления первых пестичных нитей, подтвердил у них возможность партеногенетического развития зародышей. Проэм-брио при интактных полярных ядрах был зарегистрирован в 6,75 и 1,33% зародышевых мешков, у АТТМ ( y 1, bm 2 ) и АТТМ ( y 1, bm 2, lg 1 ) соответственно. Кроме того, были выявлены зародышевые мешки со структурными отклонениями, которые характерны для апомиктич-ных форм и часто рассматриваются как косвенные ци-тоэмбриологические признаки апомиксиса. Это присутствие в зародышевых мешках более одной яйцеклетки, дополнительных полярных ядер и дополнительных клеток с неопределенной морфологией в яйцевом аппарате.

Создание генетически маркированной ли-нии-гаплоиндуктора. Если для обнаружения гаплоидов в потомстве партеногенетических линий кукурузы целесообразно использовать маркирование рецессивными генами, то в случае с линиями-гаплоиндук-торами более эффективным, как правило, является маркирование доминантными генами [23]. Чаще всего это гены, контролирующие антоциановую окраску эндосперма, зародыша, корешков, растения, пыльников и рылец. У кукурузы в качестве доноров маркёрных генов используются линии КМ (коричневый маркер), имеющий гены aВPlR и ПТ (пурпуровый тестер) с генами АВPlR. Ген А контролирует антоциановую окраску, В – усилитель окраски растения, Pl - пурпурное растение, R - окрашенный алейрон и растение. Наилучшими маркерами являются линии, имеющие гены bplАСR^Nj:cudu pr-pWr. Данные гены контролируют окрашивание алейрона зерновки и зародыша [7].

Для создания новой генетически маркированной линии-гаплоиндуктора, адаптированной к условиям Нижнего Поволжья, в качестве материнского родителя использовали растения линии ЗМС-8 (Зародышевый маркер Саратовский-8), которые несут маркерные гены, отвечающие за окраску зародыша и эндосперма (АСR-nj:cudu Pr b pl y Pwr), позволяющие выявлять гаплоиды среди сухих зерновок и проростков до 4 дня развития. Однако взрослые растения имеют зеленую окраску листьев и стебля. Эти признаки контролируются рецессивными генами, что затрудняет выявление гаплоидов среди взрослых растений в полевых условиях. В качестве отцовского родителя были использованы нелинейные формы кукурузы с пурпурной окраской стеблей, листьев и метелок (доминантные признаки). Полученные гибриды самоопылили и в течение нескольких последующих поколений проводили отбор растений по нескольким значимым признакам: высокая частота гаплоиндукции, ярко выраженная пурпурная окраска вегетативных частей растения, зародыша и эндосперма. Учитывались также и другие ценные показатели: высота растения, неполегаемость, хорошая метелка и др. Поскольку гаплоиндукторы используют в качестве опылителей, важно, чтобы высота растений была выше места расположения початков на материнских формах, метёлки имели большую продуктивность. Созданной линии было присвоено рабочее название ЗМС-П (Зародышевый маркер Саратовский-Пурпурный).

Традиционно для создания высокоэффективных гаплоиндуцирующих линий проводятся скрещивания различных форм, имеющих данную способность, а также другие ценные признаки. Далее гибридное потомство тестируют на способность к гаплоин-дукции путем опыления его пыльцой различных материнских форм, и определения частоты индукции гаплоидов и, параллельно, растения самоопыляют для воспроизводства. Среди гибридного потомства «будущих» гаплоиндукторов отбираются индивидуальные растения или семьи (потомства одного початка) с самой высокой частотой гаплоиндукции. И так проводится несколько циклов отбора. Данным способом были получены известные в настоящее время саратовские высокоэффективные гаплоиндукторы КМС, ЗМС-8 (Завалишина А.Н., Тырнов В.С.), краснодарские – ЗМК 1, ЗМК 1У, ЗМК 3 (Шацкая О.А.) и др. [10, 13]. Основная сложность способа заключается в том, что для отбора на гаплоиндуцирующую способность необходимо проводить опыление большого количества различных материнских форм с последующим анализом полученных гибридов на наличие среди них гаплоидов. При получении новой генетически маркированной линии-гаплоиндуктора мы использовали иной подход, который позволил избежать опыления большого количества материнских форм. Нами была протестирована возможность проведения отбора на гаплоиндуцирующую способность по початкам самоопыленного гаплоин-дуктора, т.е. гаплоиндуктор в скрещиваниях служил в качестве и материнского, и отцовского растения одновременно. Применение такого подхода возможно только при отсутствии у гаплоиндуцирующих линий предрасположенности к наследуемой форме партеногенеза. Для решения данного вопроса был проведен цитоэмбриологический анализ женских гаметофитов исходной линии ЗМС-8 и полученных от нее гибридов. Каких-либо признаков, указывающих на склонность к наследуемому партеногенезу, у них обнаружено не было [25, 26].

Среди самоопыленного потомства линии ЗМС-П отбирались початки вариантов, в потомстве которых в полевых условиях встречались гаплоиды. В поле высаживалось в среднем около 40 растений с каждого початка, среди которых гаплоидные растения встречались с частотой от 1 до 4. Анализ самоопыленного потомства показал, что на початках среди зерновок может встречаться от 1 до 7 гаплоидов. Нами при отборе на способность к гаплоиндукции также учитывалось наличие дефектных (щуплых, без зародыша) зерновок и череззерницы на початке. Предпочтение отдавалось початкам с большим количеством дефектных зерновок и череззерницей, поскольку было отмечено, что эти признаки положительно коррелируют со способностью к гаплоиндукции. В результате были отобраны растения с высокой частотой гаплоиндукции, имеющие пурпурную окраску всех вегетативных частей взрослого растения, высотой около 155,0±7,9 см, характеризующиеся наименьшей полегаемостью, с хорошо маркированным зародышем и эндоспермом на стадии сухих зерновок. В последующих поколениях при самоопылении эти растения стабильно сохраняли вышеуказанные признаки. Данная линия растений была названа ЗМС-П1. Гаплоиды при опылении пыльцой данной линии возникают с частотой до 10%. Наличие универсальной системы маркирования у этой линии (гены пурпурной окраски зародыша, алейрона, стебля, листьев и метелок) позволяет с высокой точностью отбирать гаплоиды среди гибридов на любой стадии развития от зерновки до взрослого растения.

Выводы: в результате проведенной селекционно-генетической работы нами были получены новые генетически маркированные линии кукурузы с наследуемым и ненаследуемым типами гаплоидии. Партеногенетические генетически маркированные линии АТТМ ( y 1, bm 2, lg 1 ) и АТТМ ( y 1, bm 2 ), характеризуются высокой частотой развития партеногенетического проэмбрио (1,33 и 6,75%, соответственно) и высокой частотой полигаметии (в среднем около 2%), что является дополнительным признаком предрасположенности к партеногенезу. Эти линии могут быть использованы для проведения генетического анализа, контроля чистоты материала, гомо- и гетерозиготности апомик-тов и других целей. Линия ЗМС-П1, адаптированная к условиям Нижнего Поволжья, может быть рекомендована к использованию в качестве нового гаплоиндук-тора. Кроме того, разработанный при ее создании метод отбора на гаплоиндуцирующую способность, может быть рекомендован как более быстрый метод получения новых линий-гаплоиндукторов, по сравнению с применяемыми сегодня в мировой практике.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности по заданию №2014/203, код проекта: 1287.