Создание и исследование полимерных тестовых структур для сканирующей капиллярной микроскопии

Сканирующая капиллярная микроскопия (СКМ, в зарубежной литературе scanning ionconductance microscopy — SICM) является одним из наиболее перспективных методов бесконтактной визуализации поверхности в жидкой среде с нано- и микрометровым пространственным разрешением. Метод основан на регистрации ионного тока через апертуру стеклянной нанопипетки (НП), что позволяет формировать изображение без механического контакта с образцом. Благодаря этому СКМ широко применяется при исследовании мягких и биологических объектов — живых клеток, мембранных структур, полимерных материалов и гидрогелей [1-4]. Отсутствие механического взаимодействия принципиально отличает СКМ от атомно-силовой микроскопии (АСМ) и делает его предпочтительным методом в задачах, где важно минимизировать деформацию поверхности.

За последние годы наблюдается активное развитие аппаратных и алгоритмических решений в области СКМ, включая мультимодальные конфигурации, усовершенствованные режимы сканирования и методы повышения пространственного разрешения [5-8]. Однако несмотря на технологический прогресс, метрологическое обеспечение метода остается ограниченным. В частности, отсутствуют стандартизованные калибровочные образцы и унифицированные процедуры проверки точности измерения линейных размеров. Это затрудняет сопоставление результатов, полученных на разных установках, и ограничивает применение СКМ в задачах, требующих количественной достоверности.

В АСМ проблема калибровки решена за счет использования сертифицированных периодических решеток, ступенчатых структур и стандартов высоты, позволяющих проводить независимую проверку масштабов по трем осям, а также измерять радиус закругления используемого зонда. Для СКМ прямое применение твердых калибровочных кремниевых структур связано с риском повреждения стеклянной НП, особенно при работе вблизи поверхности. Кроме того, необходимо учитывать, что формирование сигнала в СКМ определяется не только геометрией зонда, но и распределением ионного тока вблизи апертуры, что приводит к дополнительным геометрическим искажениям измеряемого профиля [4, 9].

Одним из возможных решений является использование мягких полимерных реплик периодических кремниевых структур, полученных методом импринтинга. Подобный подход позволяет снизить риск повреждения НП в процессе калибровки СКМ и адаптировать геометрию тест-образца к особенностям метода. Однако выбор формы калибровочной структуры требует отдельного анализа. Форма с узкими или глубокими впадинами может приводить к систематическому занижению измеряемой глубины вследствие конеч- ного радиуса апертуры и невозможности полного проникновения зонда вглубь впадины [4, 10, 11]. При этом оценка высоты объектов может искажаться и вследствие нелинейного изменения ионного тока на резких перепадах рельефа на выступающих объектах [12]. Таким образом, в случае визуализации участков резкого перепада высот структура может быть пригодна для латеральной калибровки, но не обеспечивать корректной калибровки по оси Z.

В настоящей работе в качестве калибровочного образца для СКМ рассматриваются полимерные реплики с выступами или лунками круглого профиля, снятые с периодических кремниевых структур. АСМ используется в качестве референтного метода для определения фактических геометрических параметров исходной кремниевой структуры и ее полимерной реплики. Основная цель исследования — количественно оценить применимость данной геометрии для калибровки линейных размеров в СКМ и выявить ограничения, связанные с геометрией НП и особенностями распределения ионного тока.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве мастер-образцов для импринтинга использовались две кремниевые периодические структуры: калибровочная решетка TGT01 с массивом выступающих игл (тип 1) [13], а также структура с массивом лунок (тип 2). Обе структуры характеризуются регулярным периодом и конусной геометрией элементов рельефа, что после репликации приводит к формированию массива конусных выступов и углублений.

Полимерные реплики изготавливались методом термического импринтинга с использованием термопластичного сополимера этилен-винилацетата (ЭВА), выбор которого обусловлен его относительно низким модулем упругости, эластичностью и стабильностью формы после охлаждения. Процесс репликации осуществлялся следующим обра- зом (рис. 1): ЭВА размещался на поверхности кремниевой мастер-структуры и нагревался до температуры ~170 °C, после чего проводилось механическое прижатие полимера к поверхности штампа. При нагреве полимер переходил в вязкопластичное состояние и заполнял микрорельеф структуры. После выдержки образец охлаждали до комнатной температуры (~ 25 °C), обеспечивая фиксацию формы, после чего выполнялось отделение полимерной реплики от мастер-структуры. В результате формировался инвертированный рельеф исходной кремниевой решетки.

Для определения геометрических параметров исходных кремниевых структур и полученных полимерных реплик с целью контроля измеряемой топографии использовался метод АСМ, реализуемый на приборе Ntegra Aura (НТ-МДТ, Россия). Измерения проводились в полуконтактном режиме (tapping mode) на воздухе с использованием кремниевых кантилеверов NSG01 (НТ-МДТ, Россия).

Исследования методом СКМ выполнялись в растворе фосфатно-солевого буфера (PBS) в "прыжковом" режиме (hopping mode) сканирования [6], обеспечивающем бесконтактное приближение зонда к поверхности. Сканирование проводилось на предварительно откалиброванном homemade сканирующем капиллярном микроскопе по структуре питов [14]. Контроль расстояния до поверхности осуществлялся по относительному падению ионного тока через апертуру НП, которое поддерживалось на уровне 5–10 % от начального значения.

В качестве зондов использовались стеклянные НП из боросиликатного стекла, сформированные методом тепловой вытяжки на установке PMP-107 (MDI, США). Геометрические параметры зондов контролировались с помощью сканирующего электронного микроскопа Quanta Inspect (FEI, США) в режиме регистрации вторичных электронов при вакууме около 10-4 Па и ускоряющем напряжении 20 кэВ.

Рис. 1. Схема импринтинга со стадиями, показанными последовательно стрелками слева направо.

1 — исходная гладкая подложка (поликарбонат), 2 — нагретый термопластичный ЭВА, 3 — штамп (периодическая Si структура), 4 — остывший термопластичный ЭВА

Для каждой исследуемой структуры выполнялось не менее десяти измерений профилей в различных областях поверхности. По полученным АСМ- и СКМ-изображениям определялись следующие параметры: период структуры в латеральных направлениях (оси X и Y), высота или глубина элементов рельефа (ось Z), характерный диаметр конусных элементов (у вершины или у основания).

Топографические изображения использовались для извлечения профилей поперечного сечения и построения гистограмм распределения высот. Значения, полученные методом АСМ, принимались в качестве референтных при сравнении с результатами СКМ.

Первичная обработка АСМ- и СКМ-данных выполнялась в программной среде Gwyddion [15].

Обработка включала коррекцию наклона поверхности, приведение минимального значения высоты к нулевому уровню и фильтрацию изображений для подавления высокочастотного шума. Для корректного сопоставления результатов АСМ и СКМ анализ профилей проводился при одинаковых масштабах и сопоставимых размерах областей сканирования.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИНЕЙНЫХ РАЗМЕРОВ ТЕСТОВЫХ СТРУКТУР И КАЛИБРОВКА В СКМ

АСМ- и СКМ-изображения исходных Si-структур и их полимерных реплик (рис. 2, 3) демонстрируют хорошее воспроизведение периодичности и общей топографии структур.

Рис. 2. АСМ-изображения Si-структуры типа 1 (а) и ее реплики (б); СКМ-изображения реплики (в); характерные сечения вдоль структур, взятые с представленных изображений, соответственно (г, д, е)

Рис. 3. АСМ-изображения Si-структуры типа 2 (а) и ее реплики (б), СКМ-изображения реплики (в), характерные сечения вдоль структур, взятые с представленных изображений, соответственно (г, д, е)

При этом для всех типов решеток наблюдаются систематические различия в измеряемых высотах и латеральных размерах, обусловленные конечными размерами и геометрией зондов, используемых в методах АСМ и СКМ. Поскольку исследуемые структуры характеризуются регулярным периодом и фиксированными геометрическими параметрами, они могут быть использованы в качестве тест-объектов для контроля линейных размеров в режиме СКМ.

Количественные параметры структур, измеренные методами АСМ и СКМ, приведены в табл. Полученные результаты показывают, что процесс репликации сопровождается заметным уменьшением высоты элементов рельефа и некоторым изменением их латеральных размеров.

Для высоты/глубины наблюдается значительное снижение значений: для структуры типа 1 высота уменьшилась на 58.0%, а для структуры типа 2 — на 65.5%. Это может указывать на неполное заполнение формы полимером либо на усадку материала в процессе полимеризации. Изменение периода выражено менее существенно: для структуры типа 1 период уменьшился на 8.2%, а для структуры типа 2 — на 16.4%. Диаметр вершины для структуры типа 1 увеличился на 75.9%, что указывает на сглаживание острых элементов рельефа при формировании полимерной копии.

Наблюдается систематическое занижение измеряемой высоты элементов: значения, полученные методом СКМ, оказываются ниже АСМ-данных на 25.6% для структуры типа 1 и на 35.9% для структуры типа 2. В СКМ наблюдается некоторое увеличение измеряемого периода структуры относительно АСМ-данных реплики (на 14.6% для типа 1 и на 13.7% для типа 2), что может быть связано с набуханием полимера и осо- бенностями сканирования наклонных боковых стенок.

В среднем при измерении полимерных реплик методом СКМ высота элементов уменьшается приблизительно на 30% по сравнению с АСМ-дан-ными, что не позволяет использовать такие структуры для калибровки по оси Z. Несмотря на это, периодичность и общая геометрия структур сохраняются, что позволяет использовать такие образцы для оценки латерального разрешения сканера в СКМ.

Следует отметить, что при использовании полимерных калибровочных структур необходимо учитывать возможные изменения их морфологии при длительном контакте с электролитом. Для оценки стабильности образцов была проведена выдержка структур в фосфатно-солевом растворе (PBS) в течение одной недели. В результате на поверхности полимера наблюдалось появление локальных наноразмерных пор, однако общая геометрия периодической структуры при этом сохранялась, что позволяет рассматривать такие реплики в качестве пригодных тест-объектов для калибровки СКМ по XY.

ОЦЕНКА РАЗМЕРА АПЕРТУРЫ ЗОНДА-НП

При измерениях методом АСМ использовались кремниевые кантилеверы с номинальным радиусом вершины 10 нм (рис. 4, а). В экспериментах СКМ применялись стеклянные НП из боросиликатного стекла с внутренним диаметром апертуры 100 нм, углом конусности вершины 3–5° и толщиной стенки в области апертуры 70 нм (рис. 4, б). Измеряемый диаметр скругления у дна лунки определен размерами вершины зонда, что делает возможным использование структуры лунок для оценки апертуры пипетки (рис. 4, в).

Табл. Параметры калибровочных Si-тестовых структур и их полимерных реплик после измерения в АСМ и СКМ

Структура	Параметр	Si-структура в АСМ	Реплика в АСМ	Реплика в СКМ
	Высота/глубина, нм	419 ± 7	176 ± 6	131 ± 30
Тип 1	Период, нм	2219 ± 17	2037 ± 35	2335 ± 205
	Диаметр у верши-ны/лунки, нм	87 ± 5	153 ± 18	281 ± 12
Тип 2	Высота/глубина, нм	267 ± 14	92 ± 43	59 ± 17
	Период, нм	770 ± 19	644 ± 11	732 ± 37

Рис. 4. СЭМ-изображения вершины Si кантилеверного АСМ-зонда (а), вершины зонда-НП из боросиликатного стекла (б). Схема измерения полученных методом импринтинга полимерных структур двумя типами зондов (в), где 1 — АСМ-зонд, 2 — зонд-НП, 3 — структура лунок

Рис. 5. 3D-СКМ-изображение одиночной лунки: вид сбоку (а) и в изометрии (б), сечение (в) структуры по пунктиру из (б)

Следует отметить, что АСМ-зонды имеют значительно больший угол при вершине (около 30°), что ограничивает их способность проникать в глубокие узкие каналы и приводит к увеличению скругления диаметра у дна лунки. Так, для исследуемых структур измеренный диаметр дна лунки по данным АСМ составил ~ 150 нм, тогда как, по данным СЭМ, диаметр АСМ-зонда составляет ~ 20 нм. НП, напротив, обладают малым углом при вершине (3–5°), что обеспечивает лучшую проникающую способность при исследовании структур с высоким аспектным отношением. Так, измеренный диаметр дна лунки в СКМ ~ 280 нм (рис. 5) оказывается сопоставимым с внешним диаметром апертуры используемой НП с учетом толщины ее стенок, определенным по СЭМ-изображениям ~ 250 нм (рис. 4, б). Это свидетельствует о том, что латеральное разрешение метода СКМ в значительной степени определяется эффективным диаметром апертуры НП и подтверждает возможность применения лунок для оценки апертур НП, а, следовательно, и разрешающей способности метода СКМ в диапазоне размера лунок (диаметр до ~ 1 мкм).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе продемонстрирована возможность получения полимерных реплик периодических кремниевых структур методом импринтинга и их использования в качестве тест-объектов для СКМ. Изменение периода рельефа при переходе от АСМ к СКМ составило менее 15% относительно данных для реплик, что позволяет использовать данные структуры для латеральной калибровки прибора по осям X и Y. Предложенные структуры не могут быть использованы для калибровки по Z, т.к. имеются существенные расхождения в фактических размерах структуры при измерении в СКМ.

Структуры типа лунок могут быть использованы для определения внешней апертуры пипетки с точностью ~10%. Так, диаметр дна лунки, измеренный методом СКМ (~ 280 нм), напрямую коррелирует с внешним диаметром нанокапилляра (~ 250 нм), измеренным в сканирующей электронной микроскопии, что позволяет использовать подобные структуры для оценки эффективного размера зонда и латерального разрешения метода СКМ.

Предложенная методика использования полимерных калибровочных образцов предполагает предварительный контроль геометрии реплик, например, методом АСМ. При анализе линейных размеров рекомендуется сопоставлять измеренные в СКМ значения периода и других параметров с референтными АСМ-данными.

Предлагаемые мягкие полимерные реплики представляют собой экспериментально доступную и удобную для визуализации тестовую структуру для оценки линейных размеров и пространственного разрешения в СКМ. При этом использование полимерных образцов снижает риск повреждения хрупких НП. Однако стоит учитывать, что при использовании полимерных реплик необходима периодическая поверка их структуры для учета возможных процессов их деградации и набухания.

Финансирование

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-79-00169,