Создание межвидового гибрида Capsicum annuum L. и C. frutescens L. с использованием биотехнологических подходов

П ерец является распространенной культурой, так как используется для потребления как в свежем виде, так и для приготовления специй. Род Capsicum происходит из тропической зоны Америки и включает в себя 38 видов, однако только 5 из них используют в сельском хозяйстве и выращивают для питания человека: C. annuum L., C. chinense Jacq.,C. frutescens L., C. pubescens Ruizet Pav., C. baccatum L. (var. pendulum) [1, 2]. В последнее время вместе с возрастающей популярностью перца C. annuum L. увеличивается интерес и к другим видам этого рода, которые обладают рядом селекционно важных свойств, спрос на новые сорта острого перца растет [3]. Важнейшим методом обогащения генофонда культурных растений является отдаленная гибридизация, посредством которой идет передача ценных признаков от диких видов к культурным. Она позволяет расширить спектр генетической изменчивости, а также дает возможность получения нетрадиционных форм с хозяйственно ценными признаками. К современным сортам предъявляют следующие требования: высокая товарность, качество плодов, декоративность, устойчивость к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды. C. frutescens L. – один из интересных видов перца, который приобретает популярность благодаря высокому качеству плодов, устойчивости к ряду заболеваний и разнообразию форм [4, 5]. Использование в селекции видов перца с устойчивостью к болезням, с высоким содержанием биологически активных веществ позволяет создавать продуктивные гибриды, которые не только обладают повышенной питательной ценностью, но и устойчивостью к болезням, что позволяет не применять пестициды в процессе выращивания [6, 7, 8]. Виды перца C. frutescens L. и C. annuum L. хорошо скрещиваются с образованием фертильных гибридов.

Первым этапом создания гибридов является получение чистых родительских линий. Современным методом быстрого получения чистых линий перца является культура пыльников и микроспор. Для перца гаплоидные растения впервые были получены в культуре пыльников рядом исследователей: Kuo, George, Narayanaswamy и Wang [9, 10, 11]. Дальнейшие изучения факторов, влияющих на эффективность образования эмбриоидов в культуре микроспор и пыльников, показали, что важными факторами является генотип донорного растения [12, 13, 14] и питательная среда. В частности, было показано, что результативным является культивирование пыльников и микроспор на двухслойной среде [15, 16]. Кроме того, было показано, что добавление мальтозы к питательной среде с сахарозой оказывает положительное влияние на эмбриогенез,а добавление к агаризованной части среды активированного угля положительно влияет на правильное развитие эмбриоидов [15, 16, 17, 18].

Целью нашей работы являлось создание межвидового гибрида перца острого с высокими декоративными свойствами и комплексом хозяйственно ценных признаков, в том числе с высоким содержанием биологически активных веществ. Для ускорения получения чистых родительских линий была применена культура микроспор.

Материал и методы

Исследования проводили в пленочной теплице ФГБНУ ФНЦО в московской области. Материалом исследований явилась гетерогенная сортопопуляция перца острого C. frutescens L. Сз-544-14 и чистая линия C. annuum L. (Рб-551), созданная методом классической селекции.

Получение удвоенных гаплоидов. Удвоенные гаплоидные (DH) растения C. frutescens Сз-544-14 регенерировали в соответствии с протоколом, описанным ранее [19], с некоторыми модификациями.

Донорные растения выращивали при температуре 24-25°С и фотопериоде 16 часов, освещенность 10 000 люкс.

Стерилизация бутонов. Бутоны стерилизовали 30 секунд в 96% этаноле, затем в течение 10-15 минут в 50% водном растворе коммерческого препарата «Белизна» с добавлением Твина-20 (1 капля на 100 мл раствора), затем многократно промывали в стерильной дистиллированной воде до исчезновения пены.

Выделение микроспор. Стерильные бутоны помещали в питательную среду Nitsch и Nitsch с добавлением 13% сахарозы (30 бутонов в 6 мл среды). В пробирку так же помещали стерильный магнит, после чего на магнитной мешалке проводили измельчение бутонов. Суспензию микроспор фильтровали через нейлоновый фильтр с размером ячеек 40 µм и осаждали 5 мин на центрифуге типа 5804 R (Eppendorf) при 100 g. Осадок ресуспендировали в среде и повторяли центрифугирование. Промывку микроспор повторяли дважды.

Культивирование микроспор. После выделения и промывки микроспор культивирование их проводили на двухслойной среде Nitsch и Nitsch [20] с добавлением 13% сахарозы, 2% мальтозы, 30 мг/л глутатиона и с добавлением 1% активированного угля и 0,3% фитогеля в агаризованной части среды.

Получение растений-регенерантов. Появившиеся эмбриоиды на стадии крупных глобул, а также сердцевидной или торпедовидной фазах своего развития, помещали в чашки Петри на среду В-5, содержащую 2% сахарозы, 0,5 г/л активированного угля, 0,1 мг/л гиббереллиновой кислоты и 3,0 г/л фитогеля, в стеклянных или пластиковых сосудах [21]. Для образования вторичных эмбриоидов экспланты переносили на среду 1/2 МСМ с 2% сахарозы, 0,1 мг/л БАП и 3,0 г/л фитогеля [22]. Дальнейшее культивирование проводили на стеллажах с люминесцентными лампами при 25°С и фотопериоде 14 часов, освещенности 2,5 тыс. люкс. Развившиеся проростки переносили на среду 1/2 МС с 2% сахарозы, 0,5 г/л активированного угля и 3,0 г/л фитогеля для получения сеянцев [23]. Развившиеся укорененные растения переносили в сосуды с почвой для укоренения, первые 10 дней растения были прикрыты пластиковыми прозрачными стаканчиками для сохранения повышенной влажности воздуха и лучшей акклиматизации. Определение пло-идности проводили по числу хромосом в меристематических клетках кончиков корешков или в мейотиче-ских клетках микроспор. Однако для большого числа растений эти исследования трудоемки. Поэтому использовали и косвенный метод определения плоид-ности по числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц листьев перца [24].

Гибридизация. Учитывая, что перец является факультативным самоопылителем, все скрещивания проводили с кастрацией в фазе хорошо развитых бутонов за день до раскрытия цветка. Пыльцу для опыления выбирали с бутонов непосредственно перед их раскрытием и до растрескивания пыльников [25; 26]. Межвидовую гибридизацию проводили путем опыления отцовской пыльцой кастрированных цветков материнских растений. Кастрацию проводили в фазе хорошо развитых бутонов. Опыление выполняли в день кастрации в утренние часы, с 6 до 11, свежесобранной пыльцой с последующей изоляцией опыленных цветков. Завязавшиеся на момент скрещивания плоды и раскрытые цветки удаляли. В течение вегетации проводили фенологические наблюдения по фазам развития согласно методическим указаниям [27] и по методике UPOV [28]. Агротехника выращивания селекционного материала – общепринятая для условий Цен-тральной Нечерноземной зоны России. Статистическую обработку данных проводили по Доспехову [29] с использованием пакета прикладных программ MICROSOFTEXCEL 7,0.

Содержание пигментов определяли спектрофотометрическим методом. Хлорофиллы и каротиноиды экстрагировали 100%-ным ацетоном. Их концентрацию определяли по формулам Lichtethaler [30] и Hornero-Mendez [31].

Результаты и их обсуждение

Для решения поставленной цели было проведено изучение различных видовых форм перца острого ( C. annuum L., C. chinense Jacq., C. frutescens L., C. pubes-cens Ruizet Pav., C. baccatum L.) по морфологическим и хозяйственно ценным признакам: урожайность и содержание биологически активных веществ (БАВ).

Для создания гибрида были отобраны два образца – C. frutescens L. Сз-544-14 и C. annuum L. (Рб-551), анализ характеристик данных линий позволил предположить, что гибрид между данными линиями может обладать рядом преимуществ. Исходная популяция отцовской родительской линии C. frutescens L. Сз-544-14 была гетерогенной (табл. 1).

Классическими методами, на протяжении 5 лет, отбор форм с требуемыми характеристиками (Тип 1 – раннеспелые, детерминантного типа, компактные, высотой 25-30 см, с округлой формой плода, фиолетовой окраской в технической и красной – в биоло-гиче-ской спелости) не был успешен, не удавалось достичь выравненности. В качестве донора для культуры микроспор использовали растения с фенотипом, соответствующим заданным характеристикам родительской формы. Для исключения попадания соматических клеток в инкубационную среду было проведено изолирование микроспор из пыльников и культивирование их на двухслойной питательной среде. Через 30 дней от

Таблица 1. Гетерогенность популяции C. frutescens L. Сз-544-14

Table 1. Heterogeneity of the population of C. frutescens L. Cz-544-14

Растения	Высота растения, см	Тип растения	Окраска листа	Цветок	Плод
					форма	окраска	масса
Тип 1	25-30	детерминантное / компактное	фиолетовая	фиолетовый	округлая	красная	6-10
Тип 2	100-120	детерминантное / раскидистое	фиолетовая	белый с фиолетовой каймой	треугольная	красная	10-14
Тип 3	50-70	детерминантное / неопределенное	темно-зеленая с антоцианом	фиолетовый	сердцевидная	оранжевая	6-12

Рис.1.Развитие эмбриоидов и растений регенерантов в культуре микроспор Capsicum frutescensL.Сз-544-14 А – эмбриоид на сердцевидной стадии развития, образовавшийся спустя 30 суток после начала инкубирования микроспор, B – развитие растений-регенерантов из эмбриоидов, полученных в культуре микроспор

Удвоенное гаплоидное растение 2n=24

Гаплоидное растение n=12

Fig.2.CytologicalanalysisofC.frutescens L.Cz-544-14 ofregenerantplants

Рис.3.Определение числа хлоропластов в устьичных клетнах листа:А – удвоенное гаплоидное растение, число хлоропластов в 2 замыкающих устьичных клетках 20-22 шт.B –гаплоидное растение, число хлоропластов в 2 замыкающих устьичных клетках 10-12 шт.

Fig.3.Determination ofthe number ofchloroplastsin stomatalcellsofaleaf:A – Double haploid plant, number ofchloroplastsin 2 closing stomatalcells20-22 pcs.B – Haploid plant, number ofchloroplasts in 2 terminalstomatacells10-12

начала культивирования видимые глазом эмбриоиды (фаза развития от глобулярной до сердцевидной) были перенесены для дальнейшего развития на плотную питательную среду.

Линия 1 – растение детерминантного типа, раскидистое, лист темно-зеленый со слабым антоцианом,плоды треугольной формы, пониклые, в технической спелости фиолетовый, в биологической спелости красный.

Линия 2 – растение детерминантного типа, полурас-кидистое, лист темно-зеленый с антоцианом, плод сердцевидной формы, в технической спелости фиолетовый, в биологической спелости оранжевый.

Линия 3 – растение детерминантного типа, раскидистое, лист темно-зеленый с антоцианом, плод округлой формы, в технической спелости фиолетовый, в биологической спелости темно желтый.

Линия 5 – растение детерминантного типа, сильно раскидистое, лист зеленый без антоциана, плод округ- лой формы, в технической спелости сиреневый, в биологической спелости оранжевый.

Линия 6 – растение детерминантного типа,ком-пактное, лист зеленый без антоциана, плод округлой формы,в технической спелости фиолетовый,в биологической спелости оранжевый.

Линия 7 – растение детерминантного типа,ком-пактное, лист зеленый с сильным антоцианом, плод округлой формы,в технической спелости фиолето-вый,в биологической спелости темно-красный.

Наибольший интерес для дальнейшей селекции представляла Dh-1 Линия № 4 (рис. 5). Dh-1 Л-№4 – среднеспелая линия (период от всходов до начала технической спелости плодов составляет 125 дней). Растение кустовое, штамбовое, компактное, высотой 25-30 см. Лист мелкий, фиолетовый. Плоды вверхторчащие, округлые, гладкие, глянце-вые,в технической спелости – фиолетовые,в био-

Линия 1

Линия 2

Линия 3

Линия 5

Линия 6

Линия 7

Рис.4.Гаплоидные растения C.frutescensL.в период плодоношения

Рис.5.C.frutescensL. (Сз-544-14) линия Dh 4

Fig.5.C.frutescensL. (Sz-544-14) line Dh 4

логической спелости – красные. Толщина стенки плода 1,2 мм. Масса плода 8 г.

Отобранная линия C. frutescens L. (Сз-544-14) (Dh 4) была включена в гибридизацию с линией C.annuum L. (Рб-551) которая характеризуется супердетерминантным габитусом, высотой до 20-25 см, с характерными укороченными междоузлиями и цветками «букетного типа» обусловленными геном fa – пучковатость. Лист мелкий, ланцетовидный, зеленый. Цветок белый, плоды конусовидные, вверх торчащие, светло-зеленые в технической спелости, красные в биологической спелости. Длина плода 5,8 см, диаметр 0,5 см, средняя масса 2,0 г. (рис. 6).

В результате гибридизации был получен высокодекоративный гибрид перца острого со следующими характеристиками: растение компактное, низкое. Лист мелкий, тёмно-зелёный, морщинистый. Плоды направлены вверх, букетного типа, конусовидные, короткие, гладкие, глянцевые, окраска в технической спелости фиолетовая, в биологической – красная. Число гнёзд - 3. Масса плода – 8 г, толщина стенки - 1,8-2 мм. Количество плодов до 120

Рис.7.Гибрид перца острого F 1 Рождественский букет

Fig.7.The F1 pepper hybrid Christmas bouquet штук на одном растении, длина плода 3,8 см, диаметр 1,2 см. Плоды имеют приятный вкус и сильный перечный аромат, острота – 5 баллов (по 10 бальной шкале). Урожайность плодов – 1,1-1,2 кг/м2. Данный гибрид получил название F1 Рождественский букет и был включен в Государственный реестр селекционных достижений для использования в качестве горшечной культуры, как для декоративных, так и для пищевых целей (рис. 7).

Следует отметить, что межвидовой гибрид F 1 Рождественский букет характеризуется высокими биохимическими показателями по сравнению с родительскими формами (табл. 2)

Анализ содержания красных и желтых пигментов в плодах свидетельствует о своеобразии количественного содержания каротиноидов каждого вида. Содержание красных и желтых пигментов определяет не только окраску плода, но и ее интенсивность в зависимости от их соотношения. Родительские образцы и гибридная комбинация перца имели красную окраску плодов в фазе биологической спелости, поэтому содержание красных пигментов было преобладающим, однако наибольшее количество отмечено у полученного гибрида F 1 (0,501±0,025). Сумма каротиноидов у созданного гибрида в 1,6-1,8 раза выше, чем у родительских форм. Как известно, среди овощных культур одно из лидирующих мест по содержанию витамина С занимает перец, и его содержание не зависит от окраски плода и видовой принадлежности. Содержание витамина С у межвидового гибрида F 1 Рождественский букет составляет 370±26 мг%, что в 1,2-2,5 раза выше по сравнению с родительскими компонентами.

Заключение

Гибрид перца острого F 1 Рождественский букет был создан в результате гибридизации видовых родительских форм, полученных различными методами (биотехнологическими и классическими). Для ускорения получения выровненной отцовской формы С. frutescens L. была использована технология удвоенных гаплоидов через культуру микроспор. В результате чего получены удвоенные гаплоидные растения,

Таблица 2. Содержание биохимических показателей в межвидовом гибриде и родительских формах Table 2. Content of biochemical parameters in the interspecific hybrid and parental forms

Образец Hornero-Mendez с соавт. [28] Lichtethaler [29] Содержание витамина С, мг% Содержание каротиноидов, мг/г Соотношение пигментов красные/ желтые Хл a+b, мг/г ∑ каротиноидов, мг/г желтые пигменты красные пигменты ∑ красных и желтых пигментов C. frutescens L. (Сз-544-14) 0,150±0,008 0,305±0,015 0,455±0,023 2,03±0,10 <0,003 0,498±0,025 150±10 C. annuum L. (Рб-551) 0,058±0,003 0,333±0,017 0,391±0,020 5,74±0,29 0,016±0,001 0,433±0,022 299±21 F1 Рождественский букет 0,243±0,012 0,501±0,025 0,744±0,037 2,06±0,10 0,007±0,001 0,821±0,041 370±26 отвечающие запланированной модели (компактный низкий габитус, фиолетовая окраска плода в технической спелости и красная – в биологической). Полученный гибрид сочетал все необходимые хозяйственные признаки: высокую декоративность, компактность, букетное расположение плодов, высокое содержание БАВ, вкусовые качества и аромат. Таким образом, использование в селекционном процессе отдаленной межвидовой гибридизации в сочетании с биотехнологическими подходами позволяет ускорить получение новых, форм перца острого, отвечающих запросам рынка.

Об авторах:

Мубариз Иса оглы Мамедов – доктор с.-х. наук

Алексей Алексеевич Байков – старший научный сотрудник Анна Алексеевна Матюкина – старший научный сотрудник

Aboutthe authors:

Elena A.Dzhos – Cand. Sci. (Agriculture),

,

Darya V.Shumilina – Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, , Olga N.Pyshnaya – Doc. Sci. (Agriculture),

MubarisI.Mamedov – Doc. Sci. (Agriculture)

Alexey A.Baikov – Senior Researcher

Anna A.Matyukina – Senior Researcher