Создание систем редактирования генома на основе CRISPR-CAS9 для нокаута генов FGF20 и HR в эмбриональных и генеративных клетках кур и перепелов

Создание систем редактирования генома на основе CRISPR-CAS9 для нокаута генов FGF20 и HR в эмбриональных и генеративных клетках кур и перепелов

Автор: Ветох А.Н., Сергиев П.В., Рубцова М.П., Волкова Н.А., Томгорова Е.К., Волкова Л.А., Зиновьева Н.А.

Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology

Рубрика: Структура генома и геномные технологии

Статья в выпуске: 6 т.56, 2021 года.

Бесплатный доступ

Технологии геномного редактирования с применением сайт-специфических эндонуклеаз (ZNF, TALEN, CRISPR/Cas9) находят все более широкое применение в животноводстве, в том числе в птицеводстве. С их использованием связывают надежды не только на ускорение процесса создания пород с улучшенными хозяйственно полезными признаками, высокой устойчивостью к инфекционным заболеваниям, но и с созданием особей, несущих фенотипы, привнесение которых в популяции животных и птицы методами традиционной селекции невозможно или затруднено. Одним из направлений применения технологии геномного редактирования, представляющим интерес для промышленного птицеводства в рамках улучшения товарных качеств птицеводческой продукции, может быть создание особей, лишенных оперения. Для этого мы выбрали гены FGF20 и HR , связанные с развитием и ростом волос у млекопитающих (F. Benavides с соавт., 2009) и перьев у птиц (K.L. Wells с соавт., 2012). Цель исследования заключалась в создании системы для нокаута генов FGF20 и HR у кур и FGF20 у перепелов с использованием методов редактирования генома. Инактивацию генов FGF20 и HR проводили в области III экзона каждого гена с учетом анализа их структуры. С использованием биоинформатического инструментария и ресурсов (https://zlab.bio/guide-design-resources, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) были подобраны оптимальные участки разрезания генов FGF20 и HR , а также гидовые РНК и праймеры для амплификации выбранных участков этих генов. Для создания генетических конструкций, обеспечивающих разрезание в областях, кодирующих FGF20 и HR , был выбран вектор pX458 (F.A. Ran с соавт., 2013). Для лигирования использовали гибридизованные олигонуклеотиды: 5´-CACCGAAAGATGGTACTCC-CAGAGA-3´ и 3´-CTTTCTACCATGAGGGTCTCTCAAA-5´ (для гена FGF20 кур), 5´-CACCGTCC-ATGTTTGTACACGTTGG-3´ и 3´-CAGGTACAAACATGTGCAACCCAAA-5´ (для гена FGF20 кур и перепелов); 5´-CACCGACGTGGCTGACGCGGCACT-3´ и 3´-CTGCACCGACTGCGCCA-5´ (для гена HR кур). Эффективность клонирования конструкций подтвердило секвенирование. Полученные плазмиды использовались для редактирования генома эмбриональных (фибробласты) и генеративных (примордиальные зародышевые клетки - ПЗК, сперматогонии) клеток кур и перепелов в экспериментах in vitro. Клетки-мишени трансфицировали посредством электропорации. Эффективность трансфекции оценивали на сортере клеток BD FacsAria III («BD Biosciences», США) по экспрессии маркерного гена eGFP . Доля трансфицированных in vitro эмбриональных фибробластов, ПЗК и сперматогониев кур с нокаутом гена FGF20 достигала соответственно 5,7; 0,9 и 1,2 %, с нокаутом гена HR - 7,4, 0,8 и 1,0 %. Процент эмбриональных фибробластов, ПЗК и сперматогониев перепелов с нокаутом гена FGF20 составил соответственно 6,3; 0,9 и 1,1 %. Геномная ДНК была выделена из трансформированных клеток кур и перепелов и использована для амплификации и секвенирования участков генов FGF20 и HR , в которые были внесены делеции. Показано наличие множественных мутаций в амплифицированных участках ДНК. Полученные данные свидетельствуют об успешности создания систем для нокаута генов FGF20 и HR у кур и FGF20 у перепелов с использованием генетических конструкций на основе вектора pX458.

Еще

Редактирование генома, crispr/cas9, куры, перепела, примордиальные зародышевые клетки, сперматогонии, fgf20, hr

Короткий адрес: https://sciup.org/142231902

IDR: 142231902   |   DOI: 10.15389/agrobiology.2021.6.1099rus

Список литературы Создание систем редактирования генома на основе CRISPR-CAS9 для нокаута генов FGF20 и HR в эмбриональных и генеративных клетках кур и перепелов

  • Bahrami S., Amiri-Yekta A., Daneshipour A., Jazayeri S.H., Mozdziak P.E., Sanati M.H., Gour-abi H. Designing a transgenic chicken: applying new approaches toward a promising bioreactor. Cell Journal, 2020, 22(2): 133-139 (doi: 10.22074/cellj.2020.6738).
  • Cooper C. A., Doran T.J., Challagulla A., Tizard M.L.V., Jenkins K.A. Innovative approaches to genome editing in avian species. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2018, 9: 15 (doi: 10.1186/s40104-018-0231-7).
  • Petersen B. Basics of genome editing technology and its application in livestock species. Repro-duction in Domestic Animals, 2017, 52(S3): 4-13 (doi: 10.1111/rda.13012).
  • Bhattacharya T.K., Shukla R., Chatterjee R.N., Bhanja S.K. Comparative analysis of silencing expression of myostatin (MSTN) and its two receptors (ACVR2A and ACVR2B) genes affecting growth traits in knock down chicken. Scientific Reports, 2019, 9: 7789 (doi: 10.1038/s41598-019-44217-z).
  • Kim G-D., Lee J.H., Song S., Kim S.W., Han J.S., Shin S.P., Park B.-C., Park T.S. Generation of myostatin-knockout chickens mediated by D10A-Cas9 nickase. FASEB, 2020, 34: 5688-5696 (doi: 10.1096/fj.201903035R).
  • Hellmich R., Sid H., Lengyel K., Flisikowski K., Schlickenrieder A., Bartsch D., Thoma T., Bertzbach L.D., Kaufer B.B., Nair V., Preisinger R., Schusser B. Acquiring resistance against a retroviral infection via CRISPR/Cas9 targeted genome editing in a commercial chicken line. Frontiers in Genome Editing, 2020, 2: 3 (doi: 10.3389/fgeed.2020.00003).
  • Koslová A., Trefil P., Mucksová J., Reinišová M., Plachý J., Kalina J., Kučerová D., Geryk J., Krchlíková V., Lejčková B., Hejnar J. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. PNAS, 2020, 117(4): 2108-2112 (doi: 10.1073/pnas.1913827117).
  • Oishi I., Yoshii K., Miyahara D., Kagami H., Tagami T. Targeted mutagenesis in chicken using CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports, 2016, 6: 23980 (doi: 10.1038/srep23980).
  • Oishi I., Yoshii K., Miyahara D., Tagami T. Efficient production of human interferon beta in the white of eggs from ovalbumin gene-targeted hens. Scientific Reports, 2018, 8: 10203 (doi: 10.1038/s41598-018-28438-2).
  • Stern C.D. The marginal zone and its contribution to the hypoblast and primitive streak of the chick embryo. Development, 1990, 109: 667-682 (doi: 10.1242/dev.109.3.667).
  • Mozdziak P.E., Petitte J.N. Status of transgenic chicken models for developmental biology. De-velopmental Dynamics, 2004, 229: 414-421 (doi: 10.1002/dvdy.10461).
  • Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В., Зиадинова О.Ф., Фисинин В.И. Трансгенная птица — создание и области применения (обзор). Сельскохозяйственная биология, 2019, 54(6): 1080-1094 (doi: 10.15389/agrobiology.2019.6.1080rus).
  • Mozdziak P.E., Borwornpinyo S., Mccoy D.W., Petitte J.N. Development of transgenic chickens expressing bacterial beta-galactosidase. Developmental Dynamics, 2003, 226: 439-445 (doi: 10.1002/dvdy.10234).
  • Byun S.J., Kim S.W., Kim K.W., Kim J.S., Hwang I.S., Chung H.K., Kan I.S., Jeon I.S., Chang W.K., Park S.B., Yoo J.G. Oviduct-specific enhanced green fluorescent protein expression in transgenic chickens. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2011, 75(4): 646-649 (doi: 10.1271/bbb.100721).
  • Harvey A.J., Speksnijder G., Baugh L.R., Morris J.A., Ivarie R. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens. Nature Biotechnology, 2002, 20: 396 (doi: 10.1038/nbt0402-396).
  • Rapp J.C., Harvey A.J., Speksnijder G.L., Hu W., Ivarie R. Biologically active human interferon a-2b produced in the egg white of transgenic hens. Transgenic Research, 2003, 12(5): 569-575 (doi: 10.1023/A:1025854217349).
  • Lillico S.G., Sherman A., McGrew M.J., Robertson C.D., Smith J., Haslam C., Barnard P., Radcliffe P.A., Mitrophanous K.A., Elliot E.A., Sang H.M. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. PNAS, 2007, 104(6): 1771-1776 (doi: 10.1073/pnas.0610401104).
  • Kwon M.S., Koo B.C., Choi B.R., Park Y.Y., Lee Y.M., Suh H.S., Park Y.S., Lee H.T., Kim J.H., Roh J.Y., Kim N.H., Kim T. Generation of transgenic chickens that produce bioactive human granulocyte-colony stimulating factor. Molecular Reproduction and Development, 2008, 75(7): 1120-1126 (doi: 10.1002/mrd.20860).
  • Kamihira M., Ono K., Esaka K., Nishijima K., Kigaku R., Komatsu H., Yamashita T., Kyogoku K., Iijima S. High-level expression of single-chain Fv-Fc fusion protein in serum and egg white of genetically manipulated chickens by using a retroviral vector. Journal of Virology, 2005, 79(17): 10864-10874 (doi: 10.1128/JVI.79.17.10864-10874.2005)
  • Kwon S.C., Choi J.W., Jang H.J., Shin S.S., Lee S.K., Park T.S., Choi I.Y., Lee G.S., Song G., Han J.Y. Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white. Biology of Reproduction, 2010, 82: 1057-1064 (doi: 10.1095/biolreprod.109.081687).
  • Kodama D., Nishimiya D., Nishijima K., Okino Y., Inayoshi Y., Kojima Y., Ono K., Mo-tono M., Miyake K,. Kawabe Y., Kyogoku K., Yamashita T., Kamihira M., Iijima S. Chicken oviduct-specific expression of transgene by a hybrid ovalbumin enhancer and the Tet expression system. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012, 113(2): 146-153 (doi: 10.1016/j.jbi-osc.2011.10.006).
  • Li W.R., Liu C.X., Zhang X.M., Chen L., Peng X.R., He S.G., Lin J.P., Han B, Wang L.Q., Huang J.C., Liu M.J. CRISPR/Cas9-mediated loss of FGF5 function increases wool staple length in sheep. FEBS Journal, 2017 284(17): 2764-2773 (doi: 10.1111/febs.14144).
  • Wang X., Niu Y., Zhou J., Zhu H., Ma B., Yu H., Yan H., Hua J., Huang X., Qu L., Chen Y. CRISPR/Cas9-mediated MSTN disruption and heritable mutagenesis in goats causes increased body mass. Animal Genetics, 2018, 49(1): 43-51 (doi: 10.1111/age.12626).
  • Scott B.B., Velho T.A., Sim S., Lois C. Applications of avian transgenesis. ILAR Journal, 2010, 51(4): 353-361 (doi: 10.1093/ilar.51.4.353).
  • Véron N., Qu Z., Kipen P.A.S., Hirst C.E., Marcelle C. CRISPR mediated somatic cell genome engineering in the chicken. Developmental Biology, 2015, 407(1): 68-74 (doi: 10.1016/j.yd-bio.2015.08.007).
  • Park T.S., Lee H.J., Kim K.H., Kim J.-S., Han J.Y. Targeted gene knockout in chickens mediated by TALENs. PNAS, 2014, 111(35): 12716-12721 (doi: 10.1073/pnas.1410555111).
  • Cooper C.A., Challagulla A., Jenkins K.A., Wise T.G., O’Neil T.E., Morris K.R., Tizard M.L, Doran T.J. Generation of gene edited birds in one generation using sperm transfection as-sisted gene editing (STAGE). Transgenic Research, 2017, 26: 331-347 (doi: 10.1007/s11248-016-0003-0).
  • Lee J., Kim D. H., Lee K. Muscle hyperplasia in Japanese quail by single amino acid deletion in MSTN propeptide. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21: 1504 (doi: 10.3390/ijms21041504).
  • Benavides F., Oberyszyn T.M., Van Buskirk A.M., Reeved V.E., Kusewit D.F. The hairless mouse in skin research. Journal of Dermatological Science, 2009, 53(1): 10-18 (doi: 10.1016/j.jderm-sci.2008.08.012).
  • Wells K.L., Hadad Y., Ben-Avraham D., Hillel J., Cahaner A., Headon D.J. Genome-wide SNP scan of pooled DNA reveals nonsense mutation in FGF20 in the scaleless line of featherless chickens. BMC Genomics, 2012, 13: 257 (doi: 10.1186/1471-2164-13-257).
  • Ran F., Hsu P., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols, 2013, 8: 2281-2308 (doi: 10.1038/nprot.2013.143).
  • Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plas-mids. Gene, 1990, 96(1): 23-28 (doi: 10.1016/0378-1119(90)90336-P).
  • Волкова Н.А., Багиров В.А., Томгорова Е.К., Ветох А.Н., Волкова Л.А., Зиновьева Н.А. Выделение, культивирование и характеристика примордиальных зародышевых клеток пе-репелов. Сельскохозяйственная биология, 2017, 52(2): 261-267 (doi: 10.15389/agrobiol-ogy.2017.2.261rus).
  • Dimitrov L., Pedersen D., Ching K.H., Yi H., Collarini E. J., Izquierdo S., van de Lavoir M.-C., Leighton P.A. Germline gene editing in chickens by efficient CRISPR-mediated homologous recombination in primordial germ cells. PLoS ONE, 2016, 11: e0154303 (doi: 10.1371/jour-nal.pone.0154303).
  • Taylor L., Carlson D.F., Nandi S., Sherman A., Fahrenkrug S.C., McGrew M.J. Efficient TALEN-mediated gene targeting of chicken primordial germ cells. Development, 2017, 144: 928-934 (doi: 10.1242/dev.145367).
Еще
Статья научная
QR-код для установки приложения SciUp Наведите камеру и скачайте бесплатное приложение SciUp