Создание высоколикопиновых гибридов томата с использованием традиционных методов селекции и молекулярных маркеров

Впоследнее десятилетие в России наблюдается значительное увеличение площадей, отводимых под строительство и введение в строй новых тепличных комбинатов, оснащенных современным оборудованием, для которых необходимы сорта и гибриды, отвечающие требованиям новых технологий, с одной стороны, и вкусам потребителей, с другой. В настоящее время в новых тепличных комбинатах преимущественно используют гибриды голландской селекции, которые красивы внешне, но зачастую не имеют помидорного запаха и вкуса, грубые по консистенции, так как созданы по принципу: «покупатель выбирает глазами».

Целью нашей работы стало создание отечественных гибридов для защищенного грунта с высокими вкусовыми качествами с сохранением основных параметров: высокой урожайности, стандартности, способности к хранению в течение 2-4 недель, устойчивости к болезням, а также толерантности к низкой освещенности, характерной для зимнего, ранневесеннего и позднеосеннего периода выращивания.

Одним из путей достижения такой цели является введение в генотипы сорта или гибрида комбинаций генов, контролирующих и регулирующих накопление каротиноидов, особенно ликопина. Данный каротиноид очень важен для здорового питания человека, поскольку способен поддерживать иммунный статус организма и оказывать профилактический эффект онкологических заболеваний [1, 2]. Работы в направлении повышения уровня каротиноидов в плодах томата ведутся с 60-х годов прошлого столетия. Интенсивные исследования, вызванные многогранным интересом к этим пигментам, инициировали идентификацию и характеристику всех генов и ферментов, участвующих в биосинтетических и катаболических реакциях каротиноидов [3]. В настоящее время точно установлено, что ферменты, участвующие в метаболизме каротиноидов, кодируются ядерными генами, синтезируются в цитозоле, транслоцируются в пластиды и сортируются по специфическим субдоменам органелл в зависимости от типа и морфологии пластид [4]. В селекции томатов для повышения уровня и разнообразия профиля антиоксидантов был использован метод интрогрессии спонтанных или индуцированных мутаций. Для получения линий с высоким содержанием ликопина (улучшение цвета и питательных свойств) использовали такие генетические ресурсы, как аллели, детерминирующие этапы биосинтеза, а также аллели, регулирующие формирование и развитие хлоропластов и др. Опубликованные работы показывают сложность ведения селекции с имеющимся материалом, так как часто формы, наряду с ценными признаками, демонстрировали низкие показатели продуктивности, всхожести семян и другие, что предполагает их низкую конкурентоспособность по сравнению с обычными сортами томатов и ограничивает их распространение в сельском хозяйстве [5].

С развитием методов молекулярной генетики и биотехнологии появилась возможность более целенаправленно вести эту работу. Был картирован и клонирован ряд важных генов, были созданы базы секвенированных полногеномных последовательностей [6-8], благодаря чему появилась возможность создавать простые и удобные молекулярные маркеры. Это особенно актуально в селекции на признаки, проявляющиеся на поздних этапах вегетации, такие как уровень содержания ликопина в зрелых плодах. Методы ДНК-типирования позволили при введении желаемых аллелей в ценный селекционный материал контролировать на ранних стадиях роста и развития растения возможный уровень накопления каротиноидов в плодах.

В связи с этим основными задачами настоящего исследования являлись:

• -    изучение генотипов томата с разным сочетанием структурных и регуляторных аллелей, определяющих накопление ликопина в плодах разной окраски;

• -    введение методом насыщающих скрещиваний в селекционные линии тепличных гибридов генов, контролирующих синтез ликопина, и хозяйственная оценка созданных гибридов;

• -    изучение влияния условий выращивания на накопление ликопина в плодах томата;

• -    определение состава генетических аллелей у розовоплодных гибридов томата селекции СС агрофирмы «Ильинична» – ВНИИО, имеющих самый высокий (в 4-5 раз) уровень накопления ликопина среди анализируемых генотипов;

• -    сохранение толерантности к низкой освещенности, высокой жаростойкости, а также устойчивости к наиболее вредоносным заболеваниям: кладоспориозу, ВТМ, фузариозу, мучнистой росе томата.

• -    получение гибридов с высокими продуктивными качествами, стандартностью, сохраняемостью плодов, их размером и качеством.

Особое внимание уделено гибридам розовоплодных томатов.

Материалы и методы исследований

Для исследований был использован коллекционный, мутантный, селекционный, гибридный материал томата, внесенные в Государственный реестр РФ гибриды томата селекции СС Агрофирмы «Ильинична», ВНИИО – филиала ФГБНУ ФНЦО и новые, полученные в результате работы гибриды.

Методы исследований: гибридизация и отбор генотипов, беккроссы, оценка полученных линий и гибридов методами фитопатологии, биохимии и молекулярной биологии (подбор праймеров, ПЦР и электрофоретический анализ продуктов) по требуемым параметрам.

В работе идентифицировали полиморфизм следующих генов с использованием протоколов, разработанных в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси (ИГЦ) [ 9,10]:

• -    аллелей структурного гена хлоропласт-специфичной ликопин – β -циклазы (CYC-B): beta ( b, из S. lycopersicum), Beta carotene (B из S.pеnnellii), old-gold (og) и old-gold crimson (og^c) [11];

• -    аллелей регуляторных генов, замедляющих процесс созревания плодов и биосинтеза каротиноидов ( alcobaca ( alc, nor^A ), non-ripening ( nor ) ripening inhibitor ( rin ), [12, 13];

• -    аллелей генов High pigment ( hp-1, hp-2^dg ), обеспечивающих высокое накопление пигментов в плодах [14, 15];

• -    аллелей гена SlMYB12 ( Y и y ) регулирующего накопление флавоноида халкона в кожуре плодов томата [16, 17].

Биохимический анализ проводили в ФГБНУ ФНЦО и ВНИИО – филиале ФГБНУ ФНЦО с использованием тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ [18].

Оценку устойчивости к патогенам осуществляли на высоком естественном фоне в пленочных теплицах, а также с использованием искусственного заражения согласно Методическим указаниям по селекции сортов и гибридов томата для открытого и защищенного грунта [19] и Методике селекции томата на устойчивость к мучнистой росе [20], а также ПЦР анализов. Оценку производственных качеств (урожайности, стандартности, хранения, размера, вкусовых качеств плодов и т.д.) проводили в остекленных производственных теплицах, для которых созданы гибриды.

Результаты и их обсуждение

Мутантные формы полевого томата, любезно предоставленные институтом овощеводства Украины [21], были использованы в селекционном процессе по введению аллелей генов B, og, hp1 в родительские линии 5 гибридов тепличного томата селекции СС АФ «Ильинична» методом 4-5 кратного беккроссирования. (табл.1). Эти мутанты не были устойчивыми к болезням, типичным для защищенного грунта, не приспособлены к выращиванию в условиях низкой освещенности. Первично отбор линий и гибридов с указанными генами проводили по цвету и вкусовым качествам плодов.

массы (далее с.м.) обнаружен в красных (6,46 мг) и розовых (8,20 мг) плодах. В желтоплодных и оранжевых образцах он был значительно ниже (3,99 мг). В плодах зеленой окраски присутствовали лишь следовые количества ликопина (0,86 мг). При органолептической оценке полученных гибридов было показано, что накопление ликопина выше 8 мг в плодах значительно улучшает их вкусовые качества [22]. Причем уровень накопления антиоксиданта зависит от условий выращивания гибридов, что было показано в последующие годы.

Метод интрогрессии спонтанных или индуцированных цветовых мутаций широко используется для повышения уровней и диверсификации профиля каротиноидов томата и способствует расширению высокой изменчивости, характеризующей плоды томата. Многие моногенные мутации, влияющие на пигментацию плодовых каротиноидов, были выделены в томате с конца 1940-х годов, и была выяснена их молекулярная основа. Некоторые из них вызывают более глубокую красную окраску спелых плодов, увеличивая содержание ликопина. Несколько линий томатов с высоким содержанием ликопина (HLY) были получены к настоящему времени путем интрогрессии мутаций серии hp и с og (Ilahy et al., 2018). У томатов аллели og и og^c приводят к гипераккумуляции ликопина, как это

Таблица 1. Содержание ликопина в плодах томата исходных мутантных форм Table 1. The lycopene content in tomato fruits of the original mutant forms

Мутант	Мутантные аллели качества	Содержание ликопина, мг/100 г
№ 257	В, hp1, nor	5,06
№ 259	og, u	4,66
№ 261	B, hp1	7,73
№ 262	B	7,36
№ 263	B, hp1	4,02
№ 264	B, alc	1,03
№ 265	B, hp1, gs	7,31
№ 266	B, hp1	4,85

На рисунке представлены результаты молекулярного анализа, подтверждающего наличие аллеля og у образца № 269.

В результате, был получен ряд линейных и гибридных комбинаций, которые, начиная с 2013 года, были оценены в биохимической лаборатории по содержанию ликопина в плодах. Наивысший уровень ликопина на 100 г сырой

Рис.1. Продукты амплификации ДНК сортов и линий томата с BF/BR_DdeI маркером:

1 – LA3134 (- alc - отр. контроль,

• 2- 3 – LA348 (og - контроль), 4-5 №259, 6-7 – №261 Fig. 1. DNA amplification products of tomato cultivars and lines with BF / BR_DdeI marker

было показано Bramley [23]. В зависимости от мутации линии красных спелых томатов HLY содержат различные количества ликопина и β -каротина, но обычно больше (до двух раз), чем соответствующие контрольные сорта [24].

В период с 2013 по 2018 годы проводили изучение зависимости накопления ликопина у созданных гибридов, как от условий окружающей среды, так и сочетания аллелей, детерминирующих данный признак.

Для изучения зависимости уровня накопления ликопина от температуры и солнечной радиации образцы выращивали в условиях необогреваемых пленочных теплиц в Подмосковье и параллельно в остекленных необогревае-мых теплицах Беларуси. Было установлено, что более высокий уровень солнечной радиации и температуры в Беларуси по сравнению с Подмосковьем положительно коррелирует с количеством ликопина в плодах. Так, уровень ликопина лучших гибридов составил от 8,1-11,2 мг на 100 г с.м. в Подмосковье и 15,4-22,3 мг на 100 г – в условиях Беларуси. Например, гибрид F1 Виктория, являясь стандартом по ликопину, в Беларуси в течение 5 лет имел результат 15,4-18.0 мг/100 г, тогда как в нестабильных условиях Подмосковья его уровень колебался от 6,5 до 7,5 мг. Данные результаты показывают, что отбор в менее благоприятных условиях повышает его эффективность и

Таблица 2. Биохимический состав плодов гибридов томата включенных в реестр РФ селекции СС АФ «Ильинична – ФГБНУ ФНЦО, 2016 год

Table 2. Biochemical fruit content of tomato hybrids listed in the State Register Russian Federation of breeding SS Agrofirm "Ilyinichna"– Federal Scientific Vegetable Center, 2016

Гибрид F 1	Тип роста	Сухое вещество, %	Витамин С мг/100 г массы	Нитраты, мг/кг	°Brix, %	β -каротин,     Ликопин мг/ 100 г сырой массы
Красная стрела	детерминантный	7.0	21	129	4,0	1,5	6,5
Прекрасная леди	детерминантный	8.8	31	153	5.7	1.7	7.3
Горожанка	детерминантный	7.2	21	147	4.2	1.7	6.5
Оля	супердетерминантный	5.8	24	140	3.0	2.2	7.3
Галактика	детерминантный	6.3	27	168	3.5	1.5	4.8
Леля	полудетерминантный	6.2	22	135	4.5	-	-
Подмосковный	полудетерминантный	6.5	23	169	3.1	1.4	4.7
Кавалькада	полудетерминантный	5.6	19	143	2.6	1.3	5.3
Кадриль	полудетерминантный	6.8	24	156	3.5	1.8	6.9
Вологда град	индетерминантный	-*	-	127	2.1	1.5	0.8
Диво	индетерминантный	6.7	25	156	3.7	1.1	5.3
Титаник	индетерминантный	6.3	23	130	3.5	1.5	5.2
Наша Маша	индетерминантный	-	27	164	4.0	1.1	3.8
Космос	индетерминантный	8.7	24	207	5.2	-	-
Виктория	индетерминантный	-	31	229	6.0	1.5	7.4
Вдохновение	индетерминантный	6.7	23	119	3.7	1.1	4.7
Вернисаж	индетерминантный	-	18	106	2.1	1.0	4.5
НСР05						0.8	1.24

*Значение показателя не определялось позволяет получить высокое накопление ликопина в плодах при возделывании в оптимальных условиях выращивания.

В разные годы в теплицах Подмосковья средний уровень ликопина на 100 г с.м. в плодах исследуемых гибридов колебался от 5,275 мг (2014 год) до 8,454 мг (2018 год). Наиболее благоприятными по температуре и инсоляции были 2013 (7,463 мг) и 2018 (8,454 мг) годы. Самым неблагоприятным был 2014 год. Анализ средних показателей содержания ликопина в 2013-2018 годах показал, что пониженные температуры в период вегетации и созревания плодов (2014, 2016 годы) приводят к снижению уровня ликопина почти в 2 раза.

Наряду с этими исследованиями было проведено изучение биохимического состава наших внесенных в Реестр РФ гибридов томата, выращенных в условиях пленочных необогреваемых теплиц Подмосковья. Было подтверждено, что при неблагоприятных условиях существенно снижается накопление каротиноидов и изменяется биохимический состав плода в целом (табл.2). Данные условия позволили выделить гибриды с сочетанием высоких концентраций сахара (°Brix), сухого вещества и максимальных значений ликопина, совместно определяющих прекрасные вкусовые качества: Прекрасная леди, Оля, Кадриль, Виктория. В целом, биохимические показатели значительно различались между гибридами, а в благоприятные для растений томата годы эти различия проявлялись еще выше. При этом независимо от условий выращивания розовоплодные гибриды F1 Космос, Виктория, Спутник, Галактика, 28/18, №99/18 и некоторые другие стабильно имели максимальные значения ликопина в плодах.

Наряду с оценкой влияния факторов окружающей среды, был проведен анализ содержания ликопина в плодах гибридов различного типа роста. В результате были выделены образцы с высокими показателями по ликопину: супердетерминантный: Оля; детерминантные: Бумеранг, Горожанка, Прекрасная леди, Галактика; полудетерми-нантные: Кадриль, Леля, Подмосковный, Кавалькада; индетерминантные: новый, внесенный в Реестр РФ в 2016 году гибрид Галочка (15,6 мг/100 г), а также Красный луч, Титаник, Наша Маша и другие. Было показано отсутствие связи между типом роста и накоплением ликопина, что продемонстрировано данными таблицы 2. Из результатов можно сделать вывод, что накопление ликопина не зависит от типа роста, высокий уровень наблюдается как у детерминантных, так и у полудетерминантных и индетер-минантных гибридов, и зависит от конкретных аллелей генов, контролирующих синтез ликопина.

Табл. 3. Содержание ликопина в плодах гибридов с мутантными аллелями rin, nor, alc Table 3. The lycopene content in hybrids containing mutant rin, nor, alc alleles

№гибрида	Генотип	Ликопин, мг/100 г	№ гибрида	Генотип	Ликопин, мг/100 г
145/14	B, hp1, nor	2.20	257/14	B, hp1, nor	5.06
179/14	B, og, rin	2.03	264/14	B, alc	1.03
192/14	hp1, nor	0,74	Болеро	В, rin	5.77
238/14	hp1, rin, gs	0.82	Рамзес	В, rin	5.23
253/14	B,ag, rin	0.81	Вологда град	В, rin	0.80
			Подмосковный	rin	5.70

В крупных тепличных комбинатах, где сборы плодов проводят 2-3 раза в неделю, актуальным является сохранение плодов в течение 2-3 и более недель для успешной их доставки и реализации.

Ранее, 15-20 лет назад, для создания гибридов такого типа российские и зарубежные селекционеры использовали гены rin, nor, alc ( nor^A ) и некоторые другие, задерживающие созревание плодов. При введении этих генов в генотипы гибридов в гомозиготном состоянии наблюдается практически полное отсутствие каротиноидов в плодах или незначительное их количество [11, 12]. Однако при целенаправленном отборе и подборе компонентов скрещивания можно поднять уровень до оптимальных величин. Был изучен уровень ликопина в гибридах, полученных с использованием генов nor, rin, alc (в гетерозиготе), при сочетании их с рядом аллелей, определяющих этапы биосинтеза и накопления каротиноидов ( B, hp1, og и др.). В таблице 3 представлены результаты испытания образцов селекции ССА «Ильинична» – ВНИИО филиал ФГБНУ ФНЦО. Таким образом, был достигнут уровень накопления ликопина выше 5 мг на 100 г в гибридах: Г257/14, Болеро, Рамзес, Подмосковный. Этот уровень является средним по результатам изучения нескольких лет.

Полученные результаты согласуются с данными ИГЦ НАН Беларуси, где также удалось преодолеть негативное действие генов, задерживающих или блокирующих созревание

Особую группу составили розовоплодные гибриды с высоким содержанием ликопина: Виктория, Космос, Спутник, Галактика, №28/18, 99/18 и другие. Анализ генотипов этих гибридов показал, что они имеют другой состав генов, контролирующих этот признак.

Поскольку на протяжении длительного периода розовоплодные формы характеризовались максимальным содержанием ликопина, следующим этапом стало изуче-

Таблица 4. Урожайность различных генотипов томата с аллелями замедленного созревания Table 4. Yield production in samples containing alleles inhibiting senescence

Название	Генотип	Урожайность, кг/м2		Масса плода, г
образца		ранняя	общая
LOR	og c/og c//rin/rin	0,38	9,65	61
LORД*	оg c/og c//rinwt/rinwt	3,38	5,52	99
LBN	B/B//nor/nor	0	7,87	88
LBNД	B/B//norwt/norwt	3,60	6,97	78
LBPN	B/B//hp2 dg /hp2 dg //nor/nor	0	3,84	51
LBPNД	B/B//hp2 dg/hp 2 dg /norwt/norwt	1,70	2,58	43

*rinwt*(norwt) дикие немутантные аллели

Таблица 5. Содержание каротиноидов в плодах образцов томата с различным сочетанием аллелей качества (мг/100 г массы) Table 5. Carotenoids content in tomato samples containing various combinations of alleles responsible for quality (mg/100 g)

Название образца Генотип Бета-каротин Ликопин Лютеин Хлорофилл красноплодные: LO og c/og c 1,9 11,5 2,7 0 (LOP) og c/og c//hp2 dg/hp2 dg 1,7 15,4 2,6 0 (LOG) og c/og c//gf3/gf3 2,0 11,4 2,2 0 (LOPR) og c/og c//hp2 dg /hp2 dg //rin/rin 0 0 0 2,1 (LbPG) b/b //hp2 dg /hp2 dg //gf3/gf3 2,0 6,3 1,8 9,9 (LBP) B/B//hp2 dg /hp2 dg 6,7 0 4,0 0 (LbP) b/b//hp2 dg /hp2 dg 2,8 12,4 2,7 0 розовоплодные: Малиновый коктейль b/b//y/y 3,6 22,3 3,3 0 Спутник b/b//y/y 2,4 21,8 4,5 0 Галактика b/b//y/y 3,9 19,4 3,7 0 N 263 b/b//y/y 2,0 14,2 2,3 0 N33-1/16 og/og //y/y 2,0 14,2 2,3 0 N 34-1/16 b/b//y/y 2,0 19,6 2,2 0 Виктория (стандарт) b/b//y/y 1,75 15,4 2,0 0 ние особенностей накопления ликопина в плодах при сочетании вышеописанных аллелей с аллелями гена SlMYB12 (Y и y), регулирующего накопление флавоноида халкона в кожуре плодов томата. Сочетание аллелей og c и b с аллелем Y дает малиновую и красную окраску, а с аллелем y – розовую [16, 17]. Используя разработанные ранее маркеры [10], в том числе гена SlMYB12, было проведено ДНК- типирование изучаемых аллелей и определение уровня накопления каротиноидов в образцах, в том числе шести розовоплодных гибридов селекции ССА «Ильинична», ВНИИО – филиал ФГБНУ ФНЦО. Розовоплодные гибриды имели уровень ликопина от 11,5 до 22,3 мг/100 г см что в 2 – 5 раз превышает средний уровень, каротина от 1,75 до 3,9 мг и лютеина от 2,0 до 4,5 мг одновременно (табл. 5).

Анализ полиморфизма аллелей, определяющих биосинтез каротиноидов у этих форм, показал отсутствие у них известных аллелей hp-1, hp2 dg. Впервые в Беларуси и России было показано, что главным отличием генотипа розовоплодных от красноплодных форм является сочетание рецессивного аллеля b гена ликопин-β-циклазы и рецессивного y гена SlMYBI2, блокирующего синтез желтого флавоноида халкона в кожице плодов. Эта комбинация присутствует во всех розовых гибридах российской селекции, что обеспечивает их прекрасные вкусовые качества. Шесть из них внесены в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в РФ, широко используются в тепличных комбинатах и в любительском овощеводстве. Особенно выделились по комплексу признаков (в том числе высоким содержанием ликопина) при испытании в тепличных комбинатах розовоплодные индетерминантные гибриды F1: Космос, Виктория, Г-№28/18, Г- №99/18, детерминантный Галактика и некоторые другие.

Таблица 6. Урожайность и качество плодов новых гибридов в условиях зимних теплиц Урала Table 6. Yield production and fruit quality in new tomato hybrids grown in glass greenhouses in Ural

N гибрида	Урожайность,		Масса плода,	Лежкость,	Дегустация,
	кг/м2	% к контролю	г	дней	балл
Г 950	51,2	121,0	188	45	4,2
Г 951	43,1	101,9	190	44	3,0
Г 952	40,4	95,5	181	46	З,6
Г 955	53,4	126,2	184	48	3,0
Г 956	43,0	101,6	179	46	4,8
Г 958	58,6	138,5	181	49	3,6
Г 959	58,0	137,1	177	51	3,6
Г 960	48,5	114,7	184	51	4,6
Магистраль	44,3	104,7	179	50	4,0
Юпитер	45,1	106,6	174	51	3,6
Г 12897 розовый	43,1	101.9	185	40	4,4
Памяти Мариса	44,0	104,0	177	48	3.6
Форенти (К)	42.3	100,0	192	57	3.0

НСР 05                         2,18

Малообъемная культура. Посев – 09.12.2016 года, окончание культуры – 25.10.2017 года

К настоящему времени создана новая серия отечественных красноплодных и розовоплодных гибридов для зимних теплиц с высокими показателями урожайности, массы плода и потребительских качеств. В условиях продленного оборота зимних остекленных теплиц с малообъемной гидропоникой четвертой световой зоны (Урал) данные гибридные комбинации показали высокие результаты (табл. 6).

Пять российских гибридов показали урожайность на уровне голландского контроля, а остальные новые гибриды превысили контроль по этому показателю на 6,6-38,5%. Масса плода и их лежкость также были в пределах нормы, но по вкусовым качествам 5 гибридов значительно превосходили голландский гибрид – на 1-1,8 балла, у 5 гибридов вкус плодов был лучше на 0,6 балла, признаки инфекционного заражения на растениях не наблюдались.

Заключение

Полученные научные и практические результаты позволяют целенаправленно создавать высококачественные промышленные и любительские гибриды томата с ком- плексом признаков, необходимых для их выращивания в производстве и включения в Гос. реестр.

Показано, что отбор в менее благоприятных условиях повышает его эффективность и позволяет получить высокое накопление ликопина в плодах при возделывании в оптимальных условиях выращивания.

Впервые в России и Беларуси определены оптимальные генотипы (сочетания структурных и регуляторных генов) красноплодных и розовоплодных российских гибридов, обеспечивающих повышенное накопление антиоксидантов ликопина и каротина в плодах томата: красноплодных: og^c/og^c//hp2 ^dg /hp2 ^dg //Y/Y ; розовоплодных: og/og //hp2 ^dg /hp2 ^dg //y/y; b/b// y/y.