Специфические иммунные сыворотки против актинобактерий рода Rhodococcus

Среди таксономических критериев, которые применяются при идентификации актинобактерий рода Rhodococcus, определенное значение может иметь антигенная структура бактериальных клеток, выявляемая с помощью диагностических иммунных сывороток (Ridell, 1977). Ранее нами была оценена возможность использования серологических реакций, в частности иммунодиффузии и непрямой иммунофлуоресценции для ускоренной дифференциации родококков на уровне видов (Ившина и др., 1982, 1985, 1986). Одним из наиболее трудных вопросов серодиагностики родококков является приготовление антисывороток достаточно высокой специфичности. В связи с этим нашей целью является разработка способов получе ния специфических гипериммунных сывороток против представителей недавно предложенных видов Rhodococcus и изучение их иммуногенности и антигенной специфичности.

Материалы и методы исследования

Для приготовления иммунных сывороток использовали типовые штаммы сравнительно недавно предложенных видов родококков (табл. 1). Культуры выращивали на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 30°С в течение 96 ч. Бактериальные клетки отмывали 3-4 раза стерильным физиологическим раствором (забуференным 1/15М фосфатным буфером pH 7,2) с помощью центрифугирования при 4000 об/мин в течение 15 мин.

Таблица 1

Титры антител иммунных сывороток, выявленных в реакциях иммунодиффузии в агаровом геле и непрямой иммунофлуоресценции

Штамм	Схема иммунизации	Титры антител в
		РИ	нМФА
R. coprophillus ИЭГМ 600т	0,3 мл, 1 день, подкожно, 0,3-0,5 мл, 2 дня, внутримышечно, интервал 7 дней; 0,2-0,5 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 7 дней; 0,5-0,8 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 7 дней; 0,8-1,0 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 30 дней; 0,5-1,0 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно	1:64	1:128
R. “longus” ИЭГМ 27т		1:32	1:128
R. rhodnii ИЭГМ 555т		1:64	1:64
R. zopfii ИЭГМ 673т		1:64	1:128

Примечание. Приведены максимальные разведения антисывороток, при которых наблюдались четкие линии преципитации в реакции двойной иммунодиффузии в агаровом геле (РИ) и специфическое свечение интенсивностью не менее 3+ в непрямой реакции иммунофлуоресцентции (нМФА).

Для получения водорастворимых белковых гомогенатов бактериальные клетки разрушали ультразвуком на диспергаторе «Soniprep 150 MSE» (Sanya) при ультразвуковых колебаниях 22 кГц, показаниях амперметра 0,7, экспозиции 20 мин и обязательном охлаждении бактериальной суспензии. Концентрация белка в гомогенатах, определяемая по методу Лоури с соавт., составляла в среднем 25 мг/мл (Lowry et al., 1951).

Для иммунизации использовали кроликов массой от 3 до 5 кг, у которых до иммунизации предварительно проверяли наличие в сыворотке крови нормальных антител к исследуемым бактериям.

Антисыворотки получали на седьмой день после завершающего цикла иммунизации. Готовые сыворотки хранили в замороженном виде с добавлением мертиолата натрия (1 : 5000).

Титр антисывороток определяли в реакции двойной иммунодиффузии в агаровом геле и в непрямой реакции иммунофлуоресценции. В реакции иммунодиффузии антигенами служили дезинтегрированные бактериальные клетки, в нМФА - 96часовые культуры в S-форме, выращенные на МПА.

В нМФА использовали меченую изотиоцианатом флуоресцеина антикроличью сыворотку в рабочем разведении 1 : 4 производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Приготовленные препараты просматривали под люминесцентным микроскопом «Micros» (Австрия) с объективом 90х, применяя в качестве иммерсионной среды химически чистый диметилфталат, в качестве контрастирующего красителя - бычий альбумин, помеченный родамином. Для оценки интенсивности специфической флуоресценции использовали четырехкрестную шкалу. Положительным результатом иммунофлуоресцентных реакций считали флуоресценцию клеток интенсивностью не менее 3+. Преципитационные спектры исследуемых штаммов регистрировали зарисовками.

Результаты и их обсуждение

При подборе оптимальных условий для получения высокоактивных иммунных сывороток против исследуемых штаммов бактерий учитывались следующие факторы, определяющие эффективность иммунизации: физико-химическая природа вводимого антигена (корпускулярный или водорастворимый); метод его введения; кратность и интервалы между иммунизациями. Кроме того, эффективность иммунизации существенно зависит от степени иммуногенности каждого штамма, обусловленной специфическим антигенным составом клетки, активностью лизосомальных ферментов фагоцитов макроорганизма. В ранее проведенных исследованиях было показано, что наиболее интенсивно индуцируют антителообразование в организме подопытных животных водорастворимые антигены, тогда как интактные клетки вызывают относительно слабый им мунный ответ (Ившина, 1997).

Для повышения иммунологической активности подопытных животных нами использована схема иммунизации, предусматривающая увеличение интервала между иммунизациями и введение приема отдаленной реиммунизации подопытных животных. Такая схема отличается высокой воспроизводимостью и высокой результативностью (Барбан и др., 1988). Из способов аппликации иммуногенного материала наиболее результативный интратестикуляр-ный способ, на практике он трудноосуществим, поэтому мы использовали прием сочетанного (внутримышечно и внутривенно) заражения кроликов.

В табл. 1 представлены схемы иммунизации подопытных животных, которая позволила получить диагностические иммунные сыворотки против изучаемых типовых штаммов родококков с достаточно высокими титрами антител. Несмотря на то, что данная схема является довольно длительной, относительно высокие титры антител и специфичность получаемых иммунных сывороток, а также сравнительно легкая ее переносимость кроликами-продуцентами позволили выбрать ее в качестве основной схемы иммунизации.

Для изучения относительной иммуногенности родококков четыре группы экспериментальных животных иммунизировали по однотипной схеме равными для всех бактериальных штаммов возрастающими дозами вакцин.

По нашим данным, в крови неиммунизирован-ных животных выявляются нормальные антитела по отношению ко всем исследуемым штаммам родококков в примерно равных титрах: log2 величин титров - 0,8-2,2; Р>0,05. Можно полагать, что данные антитела вырабатываются в ответ на постоянное поступление аналогичных или родственных бактериальных антигенов в кишечный тракт кроликов вместе с пищей (Шварцман, Хазенсон, 1978).

Установлено, что динамика синтеза антител у различных штаммов родококков не одинакова (табл. 2). После трех циклов иммунизации (30-й день) все животные отвечают закономерным увеличением титров антител, а на более поздних (40-й день) этапах иммуногенеза интенсивность иммунного ответа нарастает у животных, примированных вакцинами R. coprophillus ИЭГМ 600^т, R zopfii ИЭГМ 673^т, R. “longus" ИЭГМ 27. Иммунизирующее действие вакцины R. rhodnii ИЭГМ 555^т заметно проявляется лишь при увеличении дозы. Различия в степени иммуногенности исследуемых бактериальных штаммов наиболее четко проявляются в момент максимальной напряженности иммунитета после реиммунизации (80-й день).

Падение титров антител на 70-й день связано с особенностью схемы иммунизации, включающей прием реиммунизации. Согласно исследованиям Р.Б. Гольдина с соавт. (Гольдин и др., 1970), к реиммунизации животных следует приступать только после падения титра антител до 1 : 10 - 1 : 20 при

Специфические иммунные сыворотки против актинобактерий рода Rhodococcus 125

их максимальном уровне, достигнутом при первичной иммунизации. Таким образом, к 70-му дню был ориентировочно достигнут искомый уровень антител; и экспериментально найденный интервал между первичной иммунизацией и отдаленной реиммунизацией кроликов составил 30 дней.

Таблица 2

Динамика образования антител, выявляемых в реакциях двойной иммунодиффузии в агаровом геле и непрямой иммунофлуоресценции

Титр агглютининов в log2 к бактериальному штамму

Дни после первой вакцинации	R. zopfii ИЭГМ 673т	R. “longus” ИЭГМ 27	R. coprophillus ИЭГМ 600т	R. rhodnii ИЭГМ 555т
	1*	2*	3*
30	2,5±0,83	2,0+0,67	4,0+1,33	2,0+0,67
40	6,5+2,16	6,3+2,10	8,0+2,67	5,3+1,52
70	5,3±1,74	5,0+1,67	4,8+1,58	4,0+1,33
80	7,3+2,33	6,5+2,17	6,5+2,16	5,8+1,92

♦Номер группы подопытных животных (число животных в каждой экспериментальной группе равно 4).

Таблица 3

Титры преципитинов в крови кроликов, иммунизированных водорастворимыми бактериальными антигенами

Штаммы	Схема иммунизации	Титр антител в log2, выявленных в РИ
R. coprophillus ИЭГМ 600т	0,3 мл, 1 день, подкожно, 0,3-0,5 мл, 2 дня, внутримышечно, интервал 7 дней; 0,2-0,5 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 7 дней;0,5-0,8 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 7 дней; 0,8-1,0 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 30 дней;0,5-1,0 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно	6,5+2,16 (4,89+8,11)
R. “longus" ИЭГМ27Т		6,5+2,17 (5,55+7,45)
R. rhodnii ИЭГМ 555т		5,8+1,92 (4,99+6,61)
R. zopfii ИЭГМ 673т		7,3+2,33 (5,67+8,93)
R. rhodochrous ИЭГМ 62т	0,5 - 1,5 мл в смеси с неполным адьювантом Фрейнда (1:1), 4 дня, интервал 7 дней, внутримышечно; 0,25 - 0,5 мл без адъюванта, 3 дня, внутривенно	8,3±0,48 (7,27+9,93)
R. ruber ИЭГМ 333	0,5 - 1,5 мл в смеси с неполным адьювантом Фрейнда (1:1), 3 дня, интервал 14 дней, внутримышечно; 1 мл без адъюванта, один день, подкожно, интервал 30 дней; 0,25 - 1, 0 мл без адьюванта, 3 дня, внутривенно	9,0±0,55 (7,47+10,53)

Примечание. Приведены данные на 7-й день после завершающего цикла иммунизации. В скобках указан 95%-ный доверительный интервал.

После завершающего цикла иммунизации антисыворотку забирали на 7-й день после последней инъекции бактериальных антигенов.

Следует отметить, что предложенная нами схема иммунизации является более напряженной, нежели ранее разработанные оптимальные схемы получения сывороток против бактерий других видов рода Rhodococcus. В табл. 3 приведены схемы иммунизации для получения антисывороток против представителей R. rhodochrous и R. ruber (Ив-шина, 1986) с целью сравнения их эффективности с разработанной схемой иммунизации для приготовления иммунных сывороток против R. coprophillus, R. “longus”, R. rhodnii и R. zopfii. Ввиду того, что исследуемые нами штаммы, относящиеся к недавно предложенным видам родококков, обладают более низкой степенью иммуногенности, по сравнению с таковой у представителей R. rhodochrous и R. ruber, увеличение интервалов между иммунизациями и использование приема отдален ной реиммунизации позволили получить гипериммунные сыворотки с достаточно высокими титрами, выявляемыми в реакции иммунодиффузии и иммунофлуоресценции.

Таким образом, результаты проведенных исследований подтверждают тот факт, что не может существовать единого (универсального) способа получения высокоактивных иммунных сывороток против всех изучаемых штаммов родококков. В ходе построения рациональных схем иммунизации установлено, что степень иммуногенности исследуемых бактерий выражена неодинаково. С использованием разработанной схемы гипериммунизации животных комплексными антигенами родококков получены видоспецифические иммунные сыворотки против R. coprophillus ИЭГМ 600т; R. “longus" ИЭГМ 27т; R. rhodnii ИЭГМ 555т; R zopfii ИЭГМ 673т с достаточно высокими титрами антител: средние величины log2 титров преципитинов составляют 8,3+0,48 - 9,0+0,55. Полученные антисыворотки пополнили банк специфических поликлональных иммунных сывороток Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768; и успешно используются в таксономических и экологических исследованиях непатогенных актинобактерий.

Исследования поддержаны грантом Программы Президиума РАН «Научные основы биоразнообразия России». Направление 7. Проект 7.4.