Спектрофотометрические методы изучения процессов перекисного окисления липидов в остром периоде ишемического инсульта

Неотъемлемым звеном патохимического каскада в развитии любого патологического процесса является образование свободных радикалов. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) – это важная составляющая синдромов эндотелиальной дисфункции и эндогенной интоксикации, характеризующих патогенез ишемического инсульта [5].

Особое значение процессам свободнорадикального окисления липидов в развитии и течении острых нарушений мозгового кровообращения придается, прежде всего, по причине повышенной чувствительности головного мозга к действию свободных радикалов (50% сухого вещества мозга составляют ненасыщенные жирные кислоты – основной субстрат свободнорадикального окисления) [3, 4]. Дополнительными факторами развития оксидантного стресса в ткани мозга являются высокое содержание в ней аскорбата (в 100 раз больше, чем в периферической крови), участвующего в качестве прооксиданта в неферментативных процессах ПОЛ [2].

Диеновые конъюгаты, являющиеся первичными продуктами ПОЛ, относятся к токсическим метаболитам, которые оказывают повреждающее действие на липопротеиды, белки, ферменты и нуклеиновые кислоты [6]. Первичные продукты ПОЛ являются весьма нестойкими и подвергаются дальнейшей окислительной дегенерации. При этом накапливаются вторичные продукты окисления, наиболее важными из которых являются ненасыщенные альдегиды. Продуктами взаимодействия малонового диальдегида с аминосодержащими соединениями являются шиффовы основания, непрерывное накопление которых дестабилизирует мембраны и способствует деструкции клеток [2, 3].

Радикалы обладают высокой реакционной способностью, определить их обычными химическими методами невозможно.

Современные варианты спектрофотометрического анализа позволяют в одной пробе биологического материала определить раздельно продукты перекисного окисления липидов: первичные – диеновые конъюгаты, вторичные – кетодиены и сопряженные триены и конечные продукты окисления – основания Шиффа [1, 6].

Продукты ПОЛ экстрагируют смесью гептан – изопропанол, определяют содержание спектрофотометрически с раздельной регистрацией липоперокси-дов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта на длинах волн 220, 232, 278 и 420 нм [1]. Результаты выражают в единицах оптической плотности – Е. Анализируют следующие группы веществ:

Е 220 – вещества с изолированными двойными связями (ИДС), потенциальные продукты ПОЛ, измерение на длине волны 220нм;

Е232 – диеновые конъюгаты (ДК) ,первичные продукты ПОЛ, содержащие остатки жирных кислот с сопряженными двойными связями, т.е. метаболически неустойчивые и подвергающиеся дальнейшее пероксидации и разрушению, регистрируются на длине волны 232 нм;

Е278 – сумма кетодиенов и сопряженных триенов (КД+СТ)-продукты распада ненасыщенных и полине-насыщенных жирных кислот, в том числе остатков жирных кислот разрушенных фосфолипидных комплексов клеточных мембран, регистрируются на длине волны 278нм.

Е420 – шиффовы основания, продукты нейтрализации токсичных веществ образующихся в реакциях пероксидации, их классифицируют как шлаки, балласт, подлежащий выведению из организма, их непрерывное накопление дестабилизирует мембраны и способствует деструкции клеток [6].

Раздельная регистрация продуктов ПОЛ в гептане и изопропаноле дает возможность более дифференцированно оценивать их содержание по степени насыщенности и окисленности. Это связано с тем, что изопропанолом экстрагируются преимущественно липиды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты, в том числе те, которые образовались в результате процессов пероксидации, а в гептановой фазе преобладают соединения с насыщенными жирными кислотами [1]. Используя результаты замеров оптической плотности продуктов ПОЛ в гептане и изопропаноле, вычисляются относительные показатели: индексы окислен-ности липидных компонентов (ИОЛ) и степень ненасыщенности остатков жирных кислот липидных молекул (СНН).

СНН остатков жирных кислот продуктов ПОЛ в эритроцитах может косвенно отражать проницаемость и текучесть клеточных мембран – при низкой СНН проницаемость и текучесть мембран снижены, при высокой СНН мембранные комплексы более лабильны и легче подвергаются разрушению.

Цель исследования: оценка показателей оксидантного стресса в остром периоде ишемического инсульта спектрофотометрическими методами с целью определения соответствия полученных результатов литературным данным, с целью рационализации использования данного метода.

Материалы и методы исследования:

Обследованы 57 пациентов в остром периоде ишемического инсульта, которым произведен забор крови для специальных спектрофотометрических исследований. Контрольную группу составили 13 пациентов без острых цереброваскулярных событий в анамнезе, сопоставимые по половозрастным признакам и сопутствующим заболеваниям с основной группой.

Определение продуктов пероксидации липидов эритроцитов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта производили на спектрофотометре СФ-2000: Г₂₂₀, Г₂₃₂, Г₂₇₈, Г₄₂₀ – продукты пероксидации липидов в гептановой фазе липидного экстракта, замеренные на СФ-2000 на длинах волн 220, 232, 278, 420 нм, соответственно; И 220 , И 232 , И 278 , И 420 – продукты пероксидации липидов в изопропанольной фазе липидного экстракта, замеренные на СФ-2000 на длинах волн 220, 232, 278, 420нм, соответственно.

При этом Г(И) 220 - вещества с изолированными двойными связями (ИДС), Г(И)₂₃₂-диеновые конъюгаты (ДК), Г(И) 278 -сумма кетодиенов и сопряженных триенов (СТ+КД), Г(И)₄₂₀-шиффовы основания, в гептановой или изопропанольной фазах соответственно.

Индекс окисленности (ИО) липидов рассчитывали как отношение содержания продуктов ПОЛ гептановой и изопропанольной фаз к содержанию веществ с изолированными двойными связями.

ИО ДК гептановой фазы (ИОЛГ₂₃₂): ИОЛГ₂₃₂ = Г 232 / Г 220 ;

ИО (КТ +СТ) гептановой фазы (ИОЛГ₂₇₈): ИОЛГ₂₇ 8 = Г₂₇ 8 / Г₂₂ 0 ;

ИО ДК изопропанольной фазы (ИОЛИ₂₃₂): ИОЛИ₂ 3 ₂ = И₂ 3 ₂ / И₂₂ 0 ;

ИО (КД + СТ) изопропанольной фазы (ИОЛИ278): ИОЛИ278 = И278 / И220.

СНН рассчитывали как отношение липидных компонентов изопропанольной фазы к липидным компонентам гептановой фазы на соответствующих длинах волн: степень ненасыщенности ДК: СНН₂₃₂ = И₂₃₂ / Г 232 ;

степень ненасыщенности (КД + СТ): СНН₂₇₈ = И 278 / И 232.

Статистический анализ производили с использованием программы IBMSPSSStatistics 21. Распределение количественных данных проверяли с помощью теста Колмогорова-Смирнова. При нормальном распределении данных сравнение 2-х независимых групп проводили при помощи критерия Стьюдента, а динамику показателей в каждой группе парным критерием Стьюдента. При распределении данных, отличном от нормального, для сравнения применяли критерий Манна-Уитни для независимых 2-х групп и критерий Вилкоксона для сравнения динамики показателей в каждой группе.

В ходе анализа результатов спектрофотометрических исследований были получены следующие результаты (табл. 1):

Таблица 1

Показатели оксидантного стресса в исследуемой группе в сравнении с контрольной

Показатель	Исследуемая группа		Контрольная группа		р
	M	m	M	m
СННИ232	1,02	0,155*	0,24	0,126	<0,001
СННИ278	1,33	0,380*	2,37	0,445	0,005
Г232/Г220	0,89	0,067*	0,65	0,020	0,037
Г278/Г220	0,67	0,056*	0,19	0,022	<0,001
И232И220	0,77	0,094	0,59	0,164	0,645
И278И220	0,39	0,047*	1,07	0,381	0,013
Г220	0,24	0,040	0,19	0,037	0,787
Г232	0,21	0,029	0,12	0,022	0,363
Г278	0,13	0,012*	0,03	0,003	<0,001
Г420	0,02	0,004	0,008	0,003	0,620
И220	0,31	0,058*	0,05	0,027	0,001
И232	0,18	0,031*	0,04	0,021	0,002
И278	0,12	0,026	0,116	0,053	0,989
И420	0,08	0,009	0,052	0,005	0,250

Примечание: p<0,05; * - p – достоверность статистических различий между показателями исследуемой группы и контрольной группы

В результате спектрофотометрическтх исследований крови пациентов в острейшем периоде ишемического инсульта выявлены признаки активации процессов перекисного окисления липидов, а, следовательно, явлений эндотелиальной дисфункции и эндогенной интоксикации: увеличены показатели степени ненасы- щенности ДК и (КТ+СТ), индексы окисленности ДК и (КТ и СТ) гептановой фазы, продуктов пероксидации липидов, экстрагируемых смесью гептан-изопропанол (ДК изопропанольной и гептановой фаз, (КТ и СТ) гептановой фазы, веществ с ИДС и ШО изопропаноль-ной фазы).

Полученные результаты соответствуют литературным данным о роли окислительно - восстановительных процессов в патогенезе острой ишемии вещества головного мозга. Таким образом, спектрофотометрические методы определения показателей оксидантного стресса в остром периоде ишемического инсульта достоверны, их использование экономически выгодно. Целесообразно использование данных методик в более крупных научно - исследовательских проектах.

SPECTROPHOTOMETRIC METHODS