Спектрофотометрический детектор для капиллярного электрофореза и капиллярной жидкостной хроматографии. Возможность абсолютного определения оптической плотности раствора в круглом капилляре

Анализ современного состояния высокоэффективного капиллярного электрофореза (ВЭКЭ) и перспектив его применения для важнейших аналитических задач представлен в ряде обзорных и методических работ [1-6]. Настоящая статья посвящена усовершенствованию спектрофотометрического (СФ) детектора прибора ВЭкЭ, разработанного в Институте аналитического приборостроения РАН, и методики его использования.

Создание СФ-детектора для капиллярных сепарационных методов — ВЭКЭ и капиллярной жидкостной хроматографии (КЖХ, ц -ВЭЖХ) — является серьезной технической проблемой. Здесь приходится решать по крайней мере шесть сложных научно-технических задач:

• 1)    максимально увеличить интенсивность излучения в измерительном (с пробой) и сравнительном каналах;

• 2)    обеспечить их высокоточное сравнение (в диапазоне линейности >  10 ⁶);

• 3)    надежно монохроматизировать излучение в диапазоне X = 200 ^ 700 нм;

• 4)    минимизировать габариты детектора и число оптических деталей, резко уменьшить габариты электронной части прибора и его энергопотребление, снизить цену детектора;

• 5)    использовать световые зонды диаметром 0 = 50 мкм (для ВЭКЭ) и 0 = 500 мкм (для ц- ВЭЖХ), снизив при этом флуктуационный шум и дрейф: для ВЭКЭ до А А = 3П0 " ⁵ е.о.п., А А/ч = 10 " ⁴ е.о.п. и для ц- ВЭЖХ до А А = = 10 " ⁵ е.о.п., А А/ч <  10 " ⁴ е.о.п. при ширине щели монохроматора АХ <  15 нм;

• 6)    обеспечить возможность абсолютного измерения оптической плотности в круглом капилляре.

Решению задач 1, 3, 4, 5 и 6 способствовали оптимизация конструкции прибора, использование светосильного монохроматора, задач 2 и 5 — применение принципа сравнения световых потоков на основе специально разработанных интегрирующих фотоприемных устройств, задачи 4 — разработка специальных микросхем и специализированного микропроцессорного контроллера, задачи 6 — введение нового понятия "коэффициента заполнения светового потока пробой" с соответствующей корректировкой результатов измерений.

ИСТОЧНИКИ ИЗЛУЧЕНИЯ

В качестве источников излучения выбраны дуговая дейтериевая лампа типа ДДС-30 и кварцевая галогенная лампа накаливания КГМ-6.3-15. Световой поток этих ламп переключается на монохроматор с помощью зеркала, перемещаемого пневматическим устройством. Для этих ламп разработан комбинированный источник питания, обеспечивающий форсированный режим запуска и продолжительную работу при нестабильности накальных напряжений и анодного тока не более 0,01% за 1 час. При этом решена проблема автономного питания лампы с ограничением энергопотребления и тепловыделения, без высокочастотных наводок в фотоприемном устройстве (ФПУ).

МОНОХРОМАТОР

Решалась задача создания недорогой светосильной зеркальной оптической системы. Для этого:

• —    в сравнительном канале используется малая часть (не более нескольких процентов) полного излучения лампы;

• —    основное излучение используется в измерительном канале;

— применен созданный светосильный монохроматор, обеспечивающий универсальную возможность фотометрического детектирования в диапазоне X = 200 ^ 700 нм при резком уменьшении постороннего света в измерительном канале до величины менее 1%.

В монохроматоре использована оптическая система Монка — Джилисона (плоская решетка в сходящемся пучке) с относительным отверстием монохроматора 1:1. Монохроматор включает следующие оптические элементы: 2 зеркала (плоское — светоделитель и вогнутое) и плоскую диффрак-ционную решетку (180 штрихов / мм). Уменьшение изображения источника излучения в 2.5 раза определяет выходное относительное отверстие монохроматора = 1:1 (что невозможно при вогнутой решетке). Изображение источника излучения в горизонтальной плоскости выходной щели монохроматора составляет примерно 0.15 мм, а при выделяемом интервале длин волн А Х = 15 нм дисперсия монохроматора А Х/d l составляет 100 нм / мм.

ФОТОПРИЕМНЫЕ УСТРОЙСТВА (ФПУ)

Фотоприемные устройства выполнены в микросхемном исполнении в виде светостойких к ультрафиолетовому излучению кремниевых фотодиодов (чувствительность не менее 0.1 А / Вт) и преобразователей фототоков во временные интервалы с накоплением оптического сигнала и обеспечивают пороговую чувствительность до I = 10^-15 А при широком динамическом диапазоне (более 10⁶) линейного преобразования входного сигнала в выходную величину. ФПУ согласованы по размерам светового пятна и коэффициенту преобразования в измерительном и сравнительном каналах.

МИКРОПРОЦЕССОРНЫЙ КОНТРОЛЛЕР

Микропроцессорный контроллер разработан на элементной базе "Intel" и "Atmel". Контроллер:

• 1)    измеряет начальные и текущие временные интервалы ФПУ измерительного и опорного каналов Т n , Т 0 и вычисляет фототоки I n, , I 0 ;

• 2)    вычисляет текущее изменение оптической плотности A A = A lg (I 1 /1 2 );

• 3)    выдает значения сигналов A A, I n, 1 0 .

МЕТОДИКИ ИЗМЕРЕНИЙ.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Для идентификации компонентов пробы и выполнения количественных измерений нужно преобразовать результаты вычислений микропроцес- сорного контроллера по пункту 2 — текущее изменение оптической плотности AA — в абсолютные значения оптической плотности A (в единицах оптической плотности на сантиметр). При этом следует учесть особенности метода и конструкции прибора капиллярного электрофореза.

Принцип действия традиционных лабораторных спектрофотометров основан на сравнении световых потоков. В этих приборах используется световой пучок параллельных лучей, падающий перпендикулярно на стенку прямоугольной измерительной ячейки. Границы измерительной ячейки охватывают световой пучок полностью, длина пути всех лучей в жидкости одинакова и равна расстоянию между передней и задней стенками измерительной ячейки.

Детекторы приборов капиллярного электрофореза имеют существенные отличия от традиционных спектрофотометров: внутренний объем капилляра, заполненный жидкостью, имеет круглое сечение малого диаметра D (порядка 50 мкм) и находится, как это показано в методической работе [6], в сходящемся световом пучке. Этот пучок света имеет две неравные части. Лучи света первой части пучка просвечивают капилляр поперек, но длина пути лучей в жидкой среде капилляра неодинакова: чем луч дальше отстоит от оси к периферии, тем его путь короче, вплоть до нуля. Вторая часть светового пучка проходит мимо внутреннего объема капилляра и не поглощается пробой. Поэтому в круглом капилляре общее затухание светового пучка меньше, чем затухание светового пучка в измерительной ячейке прямоугольного сечения.

Ниже приводится оценка погрешностей измерения, возникающих за счет особенностей прибора капиллярного электрофореза, и рекомендации для корректировки результатов измерений. Для этого предлагается ввести два логарифмических коэффициента заполнения светового луча пробой K _λ1 и K _λ2 и использовать их для преобразования численного значения оптической плотности A D , полученного при измерении на круглом капилляре с внутренним диаметром D , в эквивалентное ему значение оптической плотности A '_O для плоской кюветы с расстоянием между стенками, равным D , с помощью следующих формул:

A ' O = K λ1 A D (1)

или

A ' O = K λ1 A D + K λ2 A D ² . (2)

Формула (1) линейна и предлагается для относительно малых значений оптической плотности, а формула (2) — для учета нелинейности детектора с круглым капилляром при больших значениях оптической плотности.

В настоящей работе предлагается методика оценочного расчета коэффициентов заполнения светового луча пробой для различных вариантов настройки оптической системы. Расчет производится путем численного интегрирования по слоям.

На рис. 1, а изображен сходящийся световой пучок. На рис. 1, б сходящийся пучок представлен как суперпозиция параллельных лучей (для круглого капилляра затухание не зависит от угла падения луча, а зависит только от длины пути). На этих рисунках штриховой линией выделены границы 10 слоев в направлении лучей света, сплошной линией обозначены средние лучи в каждом слое. Поглощение каждого среднего луча определяется длиной пути внутри капилляра.

Сравнивая рис. 1, а и рис. 1, б, можно сделать вывод, что средние лучи с одинаковыми номерами имеют почти одинаковую длину, поэтому оценочный расчет, выполненный для параллельных лучей, будет пригоден и для сходящегося пучка.

В рассматриваемых примерах используется относительная ширина светового пучка N , которая определяется конструкцией и настройкой оптической системы и равна отношению ширины светового пучка X и диаметра капилляра D :

N = X / D .

Далее приведены варианты расчета при величинах N ≤ 1 (световой пучок внутри капилляра) и N ≥ 1 (капилляр внутри светового пучка).

Длина пути средних лучей внутри капилляра определяется по известной формуле длины хорды 2 А :

A = ( hD - h ²)^0.5 .

Здесь h — расстояние от середины хорды до стенки капилляра (см. рис.1, в).

В каждом слое вычисляется отношение L длины среднего луча к диаметру:

Рис. 1. Деление внутреннего объема капилляра на слои.

а — слои при сходящемся световом пучке, б — слои при параллельном световом пучке, в — пример вычисления пути светового луча 2A при заданных величинах D и h

L = 2 A / D = 2[( h / D ) - ( h / D )²]^0.5.

Если обозначить величиной A O оптическую плотность образца, приведенную к диаметру (в численных примерах для вычисления коэффициента K _λ1 величина A O выбрана равной 0.01 е.о.п.), то оптическая плотность вещества (в единицах оптической плотности) в каждом слое A_D вычисляется следующим образом:

A D = A O L .

Коэффициент пропускания каждого слоя будет равен

τ=1/10AD .(3)

Далее вычисляется средний коэффициент пропускания для n слоев:

τS1 = ∑τ / n .(4)

Эквивалентное ему значение оптической плотности вещества в капилляре равно

AD1 = log(1 / τS1).(5)

Коэффициент заполнения первого порядка вычисляется следующим образом:

Kλ1= AO /AD1 .

С целью вычисления коэффициента заполнения второго порядка предварительно вычисляются по формулам (3–6) величины τ _{S 2} и A_{D 2} при A _O = = 0.1 е.о.п. (по отношению к величине A O = = 0.01 е.о.п. это сравнительно большая величина). Затем вычисляется эквивалентное ему приближенное значение оптической плотности A '_O с коэффициентом заполнения первого порядка K _λ1 по формуле (1):

A ' O = K λ1 A D 2 .               (7)

ется коэффициент K _λ2 :

K λ2 = ( A О - A ' О )/ A D 2 ² .       (8)

• 1    приведены результаты вычислений тов K _λ1 и K _{λ 2} для узких световых пуч-

• = 0.6, 0.8 и 1.0. Результаты при N = 1.0 вуют о том, что функция A'O = f (AD) Подстановка двух коэффициентов в

• ( 2) показывает полную компенсацию ти этой функции.

ассмотрены наиболее часто встречаю-аи, когда капилляр находится внутри учка. При этом первая часть F 1 свето-а взаимодействует с пробой, а вторая часть F 2 проходит, минуя внутренний объем капилляра.

Табл. 1. Результаты вычислений K λ1 и K λ2

N	K λ1	K λ2
0.6	1.0660	0
0.8	1.1340	0
1.0	1.2510	0.2253
1.5	1.8967	1.2230
2.0	2.5330	3.3016
2.5	3.1690	5.9971
3.0	3.8050	9.8190

Соотношение потоков определяет величину N :

N = X / D = ( F 1 + F 2 ) / F 1 .       (9)

Средний коэффициент пропускания T S 1 S вычисляется при малой величине A O , равной 0.01 е.о.п.:

T s 1 s = T 1 + ( N — 1)]/ N .         (10)

Здесь используется ранее вычисленная величина t _s 1 при N =1.

Далее вычисляются средняя величина оптической плотности A D 1 S и средний коэффициент K _{λ1 S} по формулам (5) и (6).

С целью вычисления среднего коэффициента заполнения второго порядка предварительно вычисляется по формулам (9), (10) и (5) величина A D 2 S при A O = 0.1. Затем вычисляются эквивалентное ему приближенное значение оптической плотности A ' O с коэффициентом заполнения первого порядка K _{λ1 S} по формуле (7) и коэффициент K _{λ2 S} по формуле (8).

Результаты вычислений при разных величинах N представлены в табл. 1 и на рис. 2.

По результатам вычислений можно сделать вывод о том, что коэффициенты K _λ1 и K _λ2 сильно растут при увеличении доли светового потока, проходящей мимо канала капилляра. Эти коэффициенты могут служить одним из критериев качества проектирования и настройки СФ-детектора прибора капиллярного электрофореза.

Коэффициенты K λ1 и K λ2 можно определить экспериментально. Для этого следует приготовить растворы с малой и большой концентрациями одного из компонентов пробы в буферном растворе, измерить величины их оптических плотностей D O1 и D O2 по отношению к буферному раствору на стандартном лабораторном спектрофотометре и привести к длине, равной диаметру капилляра:

А _О1 = D _O1 ∙ D и А _O2 = D _О2 ∙ D .

Эти же растворы последовательно вводятся как пробы в прибор капиллярного электрофореза, и с помощью СФ-детектора измеряются величины оптической плотности А_{D 1} и А_{D 2} этих растворов относительно буферного раствора. Коэффициенты K _λ1 и K _λ2 вычисляются по формулам (1) и (2).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Предварительно были измерены величины оптической плотности раствора бензойной кислоты 0.01мг/мл в боратном буфере на трех длинах волн на лабораторном спектрофотометре СФ-46 (производства ЛОМО) и расчетным путем приведены к диаметру капилляра 0.08 мм. Эти значения оптической плотности (в е.о.п.) приведены в столбце А O1 табл. 2. В столбце А O2 табл. 2 приведены значения оптической плотности второго раствора с концентрацией бензойной кислоты 0.1мг/мл.

Значения А_{D 1} и А_{D 2} этих же растворов измерены на разработанном нами спектрофотометре прибора ВЭКЭ "Нанофор-01".

Рис. 2. Графики функций A D = f ( A О ) и A ' О = f ( A О ), полученные по расчетным значениям A D и A '_О при N= 2

Табл. 2. Экспериментальные результаты

Длина волны нм	А O1	А D1	А O2	А D2	K λ1
224	0.0200	0.0200	0.200	0.210	1.00
254	0.0043	0.0030	0.043	0.036	1.19
274	0.0025	0.0017	0.025	0.017	1.47

В результате сравнения значений вычисленных коэффициентов K λ1 в табл. 2 и в табл. 1 можно сделать следующие выводы:

— коэффициент K λ1 незначительно возрастает с увеличением длины волны;

— его величина соответствует относительной ширине светового пучка N <  1.5, т.е. бóльшая часть света проходит через капилляр.

ВЫВОДЫ

• 1.    Коэффициенты K λ1 и K λ2 позволяют привести результаты измерений величин оптической плотности A_D при измерении в круглом капилляре к эквивалентным результатам A ' O для прямоугольной измерительной ячейки.

• 2.    Экспериментальное определение коэффициентов K _λ1 позволяет оценить качество настройки оптической системы.