Сперматогенный цикл у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом 1-го типа в ранний неонатальный период

Брюхин Г.В., Антонов С.Д. Сперматогенный цикл у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом 1-го типа в ранний неонатальный период// Морфологические ведомости.- 2019.- Том 27.- № 4.- С. 16-20. (27).04.16-20

Bryukhin GV, Antonov SD. The spermatogenic cycle of the rat’s offspring with experimental of the type 1th diabetes in the early neonatal period. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2019;27(4):16-20. (27).04.16-20

Введение. Репродуктивное здоровье является одним из важнейших показателей, характеризующих воспроизводство населения и в современной морфологии проблеме профилактики его нарушения у лиц мужского пола на разных структурных уровнях уделяется значительное внимание [1-2]. Актуальность настоящего исследования обусловлена повсеместным ростом заболеваемости сахарным диабетом, включая женщин фертильного возраста [3]. Вместе с тем, многочисленными клиническими наблюдениями показано, что у женщин с сахарным диабетом рождается физиологически незрелое потомство с выраженными признаками диабетической фетопатии [4]. Врожденные пороки встречаются в 3-4 раза чаще, чем при физиологической беременности. Предполагают, что уже на ранних этапах беременности гипергликемия нарушает формирование многих органов, в том числе сердца, почек, мозга, кишечника [5]. При этом отмечается высокая перинатальная смертность, повышенная частота неонатальных осложнений и врожденных пороков развития [6]. В то же время, в доступной литературе не удалось встретить данных об особенностях становления сперматогенеза у потомства матерей с сахарным диабетом 1 типа.

Цель исследования – анализ особенностей сперматогенного цикла в ранний неонатальный период у потомства самок крыс с экспериментальным диабетом 1 типа.

Материал и методы исследования. Исследования проведены на белых лабораторных крысах Вистар (самках) и их новорожденном потомстве. Для достижения поставленной цели у взрослых лабораторных животных моделировался сахарный диабет 1 типа. Сахарный диабет создавали по методe с использованием стрептозотоцина [7], который вводили внутрибрюшинно трижды с интервалом 7 дней. Всего лабораторные животные за весь курс получали по 17 мг стрептозотоцина. Под влиянием стрептозотоцина у лабораторных животных развивался сахарный диабет, о чем свидетельствовал, прежде всего, повышенный уровень содержания глюкозы в крови (32,56±2,44 ммоль/л), который сохранялся на протяжении, как минимум, трех месяцев. Эту группу (группа О) составили 12 новорожденных крысят из 9 пометов. Контрольную группу (группа К) составили 10 новорожденных крысят из 8 пометов. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с действующими международными правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных.

У лабораторных животных интактной и опытной групп проводился цитологический анализ зародышевых клеток семенников. Оценка сперматогенного эпителия проводилась на серийных гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Морфометрически проводилось определение площади паренхимы и стромы семенников, семенных извитых канальцев, суммарного количества сперматогенных клеток и их субпопуляционного состава из расчета на один извитой семенной каналец. Оценке подлежали 30 строго поперечных срезов извитых семенных канальцев, в каждом из которых осуществлялся суммарный подсчет клеток сперматогенного эпителия. Согласно данным литературы, наиболее чувствительным морфологическим критерием активности сперматогенеза является содержание сперматогоний в извитых семенных канальцах и их субпопуляционный состав [8-9]. Подсчет сперматогоний проводился с определением числа активных (сперматогонии А) и неактивных (сперматогонии В) сперматогоний [9-10]. Учитывая, что в каждом семенном извитом канальце имеются сперматогонии, которые не могут быть отнесены по морфологическим признакам ни к активным (А) и ни к неактивным (В) клеткам, принято выделять промежуточные (П) формы сперматогоний, что позволяет более точно оценить особенности сперматогенного цикла у экспериментальных животных [9, 11]. Цитологический анализ клеток сперматогенного эпителия производился при увеличении в 400 раз (окуляр х10; объектив х40). Кроме того, для оценки более тонких нарушений сперматогенного цикла экспериментальных животных проводилось определение индекса сперматогенеза (отношение числа слоев сперматогенного эпителия к числу подсчитанных канальцев), индекса напряженности сперматогенеза (индекс релаксации сперматогенеза), клеточный индекс (отношение суммарного содержания зародышевых клеток различных типов, в том числе сперматогоний, сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов, к числу сустентоцитов) и герминативного индекса (отношение числа сперматогоний к числу сустентоцитов). Полученные результаты были статистически обработаны с использованием программы Statistica v.6.0. Учитывая небольшую выборку животных, достоверность полученных результатов определялась при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты исследования и обсуждение. Установлено, что у новорожденных крысят от матерей с экспериментальным сахарным диабетом весовой индекс семенников снижен по сравнению с контролем. Так, если у интактных крысят весовой индекс семенников составил 0,09±0,004%, то у подопытных животных исследуемый показатель составил всего 0,06±0,003% (р<0,001). Вместе с тем, у подопытных крысят выявлено увеличение толщины соединительнотканной капсулы яичка (48,66±1,77 мкм, p=0,007) по сравнению с контролем (38,30±3,2 мкм). Одним из показателей, отражающих морфофункциональное состояние органа, является соотношение площади паренхимы и стромы семенника. Установлено, что у подопытных животных имеет место снижение площади паренхимы (19174±686,4 мкм², p=0,036) и увеличение площади стромы (16346±686,4 мкм², p=0,036) семенников по сравнению с группой сравнения (соответственно 21160±335,39 мкм² и 14360±335,39 мкм²). В связи с этим, коэффициент, отражающий отношение площади паренхимы семенника к строме, у подопытных животных оказался более низким (1,305±0,09, p=0,036) по сравнению с контролем (1,486±0,059). Эти данные согласуются с результатами, полученными при анализе площади семенных извитых канальцев. При этом у новорожденных крысят от матерей с экспериментальным сахарным диабетом имеет место снижение величины площади (1766±52,97 мкм², p<0,001) семенных извитых канальцев по сравнению с группой контроля (2212±76,43 мкм²).

Рис. 1. Семенник новорождённого крысёнка контрольной группы. Окр.: гематоксилином-эозином. Ув.: х100.

Рис. 2. Семенник новорождённого крысёнка опытной группы. Повышено содержание соединительнотканного компонента и снижено содержание паренхимы. Окр.: гематоксилином-эозином. Ув.: х100.

Одним из важнейших критериев состояния сперматогенного цикла является показатель суммарного содержания сперматогенных клеток и их субпопуляционный состав [11]. Как видно из таблицы 1, у подопытных крысят наблюдается снижение как суммарного содержания сперматогенных клеток, так и общего количества сперматогоний и их разновидностей. Выявленные изменения сперматогенного эпителия обусловили снижение у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом индекса сперматогенеза (1,39±0,013, p<0,001) по сравнению с контролем (1,69±0,037). Эти данные находятся в полном соответствии с изменением герминативного индекса. В частности было установлено уменьшение (1,84±0,101, p=0,001) данного показателя у потомства опытной группы животных по сравнению с группой контроля (2,4±0,085).

На фоне изменения субпопуляционного состава сперматогоний у подопытных животных произошло снижение содержания сперматоцитов. Так, установлено, что у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом содержание сперматоцитов из расчета на один семенной извитой каналец снижено по сравнению с интактной группой.

Согласно современным представлениям, в регуляции процесса сперматогенеза у млекопитающих активное участие принимают клетки Сертоли. В частности показано, что клетки Сертоли создают специальное микроокружение, необходимое для направленной дифференцировки сперматогенных стволовых клеток, лежащих на базальной мембране семенных извитых канальцев [12].

Таблица 1

Рис. 3. Семенник новорождённого крысёнка контрольной группы. Окр.: гематоксилином-эозином. Ув.: х400.

Рис. 4. Семенник новорождённого крысёнка опытной группы. Снижено количество сперматогеных клеток в семенных извитых канальцах. Окр.: гематоксилином-эозином. Ув.: х400.

Клеточный состав сперматогенного эпителия (М±т)

Название группы	Сустен-тоциты	Содержание сперматогоний				Сперматоциты	Суммарное содержание спермато-генных клеток
		А	П	В	Z
Конт-	4,12±0,03	6,93±0,33	2,55±0,17	0,41±0,02	9,89±0,32	0,79±0,05	10,68±0,30
троль		69,86±1,69%	25,91±1,56%	4,23±0,31%
Опыт	4,08±0,09	5,48±0,25*	1,68±0,27*	0,28±0,01*	7,43±0,28*	0,54±0,04*	7,97±0,28*
		74,17±3,42%	22,10±3,29%	3,73±0,16%

Примечание: * - результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,05)

Установлено, что содержание сустентоцитов из расчета на один семенной извитой каналец у экспериментальных животных опытной и интактной групп практически не отличалось. При этом индекс напряжённости сперматогенеза, отражающий отношение суммарного количества сперматогенных клеток к содержанию сустентоцитов, в силу изменения суммарного количества сперматогенных клеток у подопытных животных оказался существенно сниженным (1,97±0,102, p=0,001) по сравнению с контролем (2,59±0,08). Логично предположить, что выявленное снижение процентного содержания сустентоцитов в семенных извитых канальцах подопытных животных может явиться одной из причин нарушения сперматогенного цикла у потомства.

Известно, что сустентоциты оказывают существенное влияние на процессы пролиферации и дифференцировки зародышевых клеток. Экспериментальными работами показано, что при сахарном диабете могут изменяться свойства мембран клеток [13]. Выявленные нарушения сперматогенного цикла у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом 1-го типа могут быть обусловлены, прежде всего, снижением соотношения числа сустентоцитов к суммарному содержанию развивающихся половых клеток и их субпопуляционного состава. Изменение регуляторного влияния со стороны сустентоцитов, в свою очередь, может обусловить нарушения пролиферации клеток сперматогенного эпителия и, как следствие, привести к уменьшению числа зародышевых клеток. В целом полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что у самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом 1-го типа рождается потомство с нарушенным стартом здоровья, в том числе репродуктивного.

Заключение. Таким образом, установлено, что у самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом 1-го типа рождается потомство с нарушением морфофункционального состояния сперматогенного цикла, что находит свое проявление в снижении суммарного количества сперматогенных клеток и их субпопуляционного состава, и, как следствие, в уменьшении индекса сперматогенеза и герминативного индекса.

Авторы сообщают об отсутствии каких-либо конфликтов интересов при планировании, выполнении, финансировании и использовании результатов настоящего исследования.