Способ количественной оценки состояния суставного хряща на разных уровнях структурной организации

Автор: Ступина Т.А., Щудло М.М.

Журнал: Гений ортопедии @geniy-ortopedii

Статья в выпуске: 1, 2009 года.

Бесплатный доступ

Разработан способ количественной оценки комплекса параметров суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях по полутонким срезам большой площади. Предлагаемый способ количественной оценки позволяет получить объективную информацию о степени реактивно-деструктивньгх изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в условиях удлинения конечности, а также может быть рекомендован для обработки биопсийного материала с целью диагностики суставной патологии и изучения влияния различных факторов на состояние суставного хряща.

Суставной хрящ, удлинение, компьютерная морфо- и стереометрия

Короткий адрес: https://sciup.org/142121178

IDR: 142121178

Текст научной статьи Способ количественной оценки состояния суставного хряща на разных уровнях структурной организации

Длительное ограничение движений при дистракционном остеосинтезе создает проблему сохранения функции суставов [3]. На данный момент в вопросах суставной патологии существует необходимость разработки способов объективной комплексной количественной морфологической оценки репаративных и адаптационных изменений суставного хряща. Известны способы количественной оценки по целлоидиновым, парафиновым, полутонким и ультратонким срезам, позволяющие характеризовать состояние суставного хряща на определенном уровне структурной организации [2]. Работа с целлоидиновыми срезами не дает возможности четко дифференцировать зоны хряща, изогенные группы клеток, проводить морфометрию без поправок на эффект Холмса [1]. Изготовить качественные 1-2 мкм парафиновые срезы суставного хряща проблематично, требуется более плотная заливочная среда (эпоксидные смолы), а использование полутонких эпоксидных срезов ограничивает их малая стандартная площадь – до 1 мм2, затрудняющая получение репрезентативных выборок изображений для стереологиче-ских исследований.

Цель. Разработать способ количественной оценки комплекса параметров суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях структурной организации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследован суставной хрящ наружного мыщелка бедра собак (n=9), 1 которым удлиняли голень аппаратом Илизарова на 28-30 мм (эксперимент выполнен д.м.н. С.А. Ерофеевым) в течение 10 суток с темпом 3,0 мм за 180 приемов (автодистракция). Перпендикулярные суставной поверх-

Т.А. Ступина - научный сотрудник экспериментального отдела травматологии и ортопедии, к.б.н.;

М.М. Щудло - ведущий научный сотрудник научно медицинского отдела восстановительного лечения, д.м.н.

ности полутонкие эпоксидные срезы большой площади готовили на ультратоме "Nova" (LKB, Швеция), окрашивали метиленовым синим и основным фуксином. На фотомикроскопе "Оpton" (Германия) с АПК “DiaMorph” (Москва) изображения препаратов оцифровывали, морфометриро-вали. В качестве контроля морфометрировали суставной хрящ интактных животных (n=3). Анализ цифрового материала проводили методами вариационной и непараметрической статистики в программе Microsoft Excel 97.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Универсальными, для определения абсолютных и относительных параметров структур суставного хряща, являются полутонкие срезы, позволяющие проводить светооптические исследования при больших увеличениях на клеточном и субклеточном уровнях. Учитывая, что толщина таких срезов (0,5-1 мкм) примерно равна 1/20 среднего диаметра изучаемых структур (диаметр хондроцитов 10-20 мкм) эффект Холмса сводится к минимуму. Для репрезентативности оценок параметров использовали срезы максимально большой площади от 4 до 8 мм2. Так, полутонкие срезы суставного хряща площадью до 8 мм2 при инструментальном увеличении 1250× позволяли оцифровать от 60 до 100 полей зрения с изображениями 120 и более клеток. Для оценки состояния суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях определяли комплекс параметров: толщина хряща (h, мкм); численная плотность хондроцитов (NАхц) - характеризует численный состав хондроцитов, их гибель и репродукцию; объемная плотность хондроцитов (УУхц, %) - характеризует степень дифференцировки клеток по зонам хряща; величина пула пролиферировавших хондроцитов (ВППХц, %) - характеризует пролиферативную активность (табл. 1). Для характеристики функциональной активности клеток определяли параметры: объемная плотность ядра (УУя, в долях единицы); объемная плотность цитоплазмы (УУцит, в долях единицы); ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ); минимальный и максимальный диаметры (dmin, dmax, мкм) клеток и их ядер; фактор формы (Ff, в долях единицы) клетки и ядра (табл. 2).

Таблица 1 Количественные характеристики суставного хряща на органном и тканевом уровнях

Параметры		VV хц (%,М)	NA хц (M m)	h (мкм, M m)	ВППХц (%)
Контроль
Контроль	I	6,1	8,2 0,99	475,5 1,3	14,5
	II	8,75	4,4 0,64
	III	12,26	5,7 0,75
3 мм за 180 приемов (автодистракция)
10 дней дистракции	I	4,1*	8,01 0,6-	375,7 1,8 ***	22
	II	4,68*	5,31 0,68*
	III	5,54*	4,03 0,45*
30 дней фиксации	I	4,52*	5,52 0,37*	439,5 1,8 ***	31,3
	II	5,64*	4,5 0,32*
	III	6,01*	4,61 0,36*
30 дней без аппарата	I	5,84*	7,88 0,7*	446,8 1,6 ***	27,5
	II	8,38	5,68 0,36*
	III	9,82*	6,46 0,43*

Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. При определении достоверности различий с контролем для УУ хц , NA_хц - использовали критерий Вилкоксо-на, для h_хр - критерий Стьюдента. Различия достоверны: *** - при р<0,001, * - при р<0,05.

Таблица 2

Количественные характеристики (M m) хондроцитов суставного хряща на этапах эксперимента (автодистракция - 3 мм за 180 приемов)

Срок эксперимента		Контроль	Дистракция	Фиксация	Без аппарата
Поверхностная зона
Vv ядра		0,42±0,01	0,29±0,01***	0,28±0,009***	0,32±0,01***
Vv цитоплазмы		0,58±0,01	0,71±0,01***	0,71±0,009***	0,678±0,01***
ЯЦИ		0,75±0,03	0,44±0,03***	0,409±0,01***	0,50±0,03***
Клетка	d min	1,28±0,25	3,19±0,46***	3,46±0,3***	3,43±0,46***
	d max	10,75±0,35	11,1±0,47	11,2±0,4	10,5±0,3
	Ff	0,47±0,015	0,61±0,02***	0,58±0,02***	0,62±0,02***
Ядро	d min	1,08±0,16	1,3±0,26	1,7±0,2***	2,2±0,23***
	d max	6,71±0,25	5,9±0,4**	5,7±0,26***	5,58±0,33***
	Ff	0,5±0,025	0,54±0,02	0,61±0,02***	0,67±0,03***
Промежуточная зона
Vv ядра		0,21±0,01	0,19±0,01	0,19±0,007**	0,22±0,009
Vv цитоплазмы		0,79±0,01	0,80±0,01	0,81±0,007**	0,77±0,009
ЯЦИ		0,27±0,01	0,26±0,02	0,25±0,01**	0,29±0,01
Клетка	d min	5,8±0,83	6,02±0,78	7,02±0,55*	8,67±0,4***
	d max	13,1±0,43	11,2±0,46*	12,2±0,38	13,7±0,34
	Ff	0,7±0,015	0,75±0,01*	0,76±0,01*	0,79±0,01*
Ядро	d min	2,1±0,34	0,9±0,2***	1,8±0,33***	3,9±0,3***
	d max	6±0,25	4,7±0,4***	5,6±0,29	6,01±0,17
	Ff	0,7±0,02	0,48±0,04***	0,64±0,02*	0,8±0,03***
Глубокая зона
Vv ядра		0,19±0,01	0,21±0,01	0,23±0,01**	0,20±0,01
Vv цитоплазмы		0,81±0,01	0,79±0,01	0,76±0,01**	0,79±0,01
ЯЦИ		0,25±0,01	0,27±0,01	0,33±0,02**	0,26±0,01
Клетка	d min	4,8±1,02	5,8±0,63	5,2±0,6	8,64±0,37***
	d max	12,4±0,4	11,2±0,44*	10,6±0,44***	13,4±0,39*
	Ff	0,69±0,02	0,75±0,01*	0,72±0,02**	0,79±0,01***
Ядро	d min	1,29±0,3	0,95±0,33	1,5±0,3***	3,1±0,37***
	d max	5,9±0,35	5,14±0,36*	5,13±0,37**	5,9±0,16
	Ff	0,6±0,035	0,5±0,03*	0,63±0,03	0,75±0,02***

Примечание: проверка различий проведена с помощью критерия Вилкоксона:* - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.

ВЫВОДЫ

Разработанный способ количественной оценки комплекса параметров суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях по перпендикулярным суставной поверхности полутон-ким срезам большой площади у экспериментальных и интактных животных позволяет без дополнительных технических и материальных затрат получить объективную информацию о степени реактивно-деструктивных изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в условиях удлинения конечности, а также может быть рекомендован для обработки биопсийного материала с целью диагностики суставной патологии и изучения влияния различных факторов на состояние суставного хряща.

Рис. 1. Полутонкий срез суставного хряща, окраска метиленовым синим-основным фуксином: а - об. – 6,3, ок. - 12,5×;

б - об. – 40, ок. - 12,5×; в - об. – 100МИ, ок. - 12,5×

Статья научная