Способы спекания, склеивания и химической сварки растворителем при изготовлении полимерных и полимер-стеклянных микрочиповых устройств

Относительно низкая стоимость полимерных материалов, способов формирования в них микро-размерных структур, а также физико-химические свойства определяют устойчивую тенденцию использования полимеров в качестве конструкционных материалов при создании микрочиповых устройств (микрочипов).

Герметизация микроразмерных структур, как правило, является финальной стадией изготовления устройств. Она производится для создания внутри микрочипа сети закрытых и связанных между собой микроструктур, пригодных для выполнения различных манипуляций с жидкой пробой и реагентами. Простейшая конструкция микрочипа представляет собой неразъемное соединение, по крайней мере, двух пластин, одна из которых имеет сеть соединенных между собой каналов (канализированная пластина), а другая является защитной и предназначена для их герметизации. Способы соединения пластин микрочипа зависят от применяемого материала и условий эксплуатации.

Среди листовых полимерных материалов в настоящее время востребованными являются органическое (акриловое) стекло, полиметилметакрилат (ПММА) и поликарбонат (ПК), обладающие подходящими оптическими, физико-химическими (устойчивость к термохимическому воздействию), механическими (прочность, твердость, устойчивость к механическим нагрузкам) характеристиками. По литературным данным [1–3], эти материалы являются химически и биологически инертными, что обусловливает их применение при создании миниатюрных устройств для методов молекулярной диагностики и генетических исследований (например, электрофоретическое разделение, цитометрия, полимеразная цепная реакция).

В статье приводятся результаты технологических исследований по герметизации полимерных микрочиповых устройств из ПММА, предназначенных для методов молекулярной диагностики, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Подробно рассмотрены методы неразъемного соединения полимерных пластин, а именно — спекание, склеивание фотоотверждаемыми композициями и химическая сварка растворителем. Предложенные технологии герметизации для мик-рочиповых устройств обеспечивают эффективное проведение ПЦР.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

Использованные материалы

В России имеется собственное производство сертифицированного ПММА (г. Дзержинск) [4–6], что обусловливает его доступность для российских исследователей и низкую стоимость. Из ассортимента, предлагаемого ОАО "ДОС", были выбраны следующие марки ПММА.

- ТОСП^® (ГОСТ 17622-72, ТУ 2216-27105757593-2001) — классический пластифицированный полимер эфира метакриловой кислоты, изготовленный методом полимеризации в блоке. Температура размягчения ( Т р ) — не ниже 92 °С. Эта марка оргстекла выпускается уже длительное время, и его свойства достаточно хорошо изучены.

- ТОСН (ГОСТ 17622-72, ТУ 2216-27105757593-2001) — непластифицированное блочное акриловое стекло с добавкой светостабилиза-тора. Материал имеет высокую стойкость к нагрузкам и термохимическому воздействию и не предполагает обработку методом формования. Температура размягчения ( Т р ) — не менее 110 °С.

- ACRYMA^®72 (ТУ 2216-030-55856863-2004), представляющий собой экструзионный акриловый пластик. Материал пластичен и способен во время обработки выдерживать нагрузки. Температура размягчения ( Т р ) — 100÷105 °С.

Особенностью проведения ПЦР является многократное (от 25 до 50 циклов) циклическое нагревание и охлаждение от 55 до 95 °С. Поэтому материал для микрочипов выбирали на основании данных по температуре размягчения ( Т р ). Понижение Т р при добавлении пластификатора вызвано тем, что молекулы пластификатора экранируют полярные группы макромолекул полимера, что приводит к ослаблению межмолекулярного взаимодействия в системе. Чем больше добавлено пластификатора, тем сильнее снижается Т _р [7]. Отсутствие пластификатора в ПММА ТОСН обусловливает более высокую стойкость данного материала к механическим нагрузкам и термохимическому воздействию по сравнению с марками ТОСП^® и ACRYMA^®72.

Следует также отметить, что на силу межмолекулярных взаимодействий в полимере влияют и особенности технологии его получения. В экструзионном оргстекле межмолекулярные связи являются более слабыми по сравнению с литым (блочным) оргстеклом. Вследствие этого можно ожидать, что ПММА ACRYMA®72 будет иметь наименьшую химическую устойчивость и лучшую способность к склеиванию по сравнению с марками ТОСП® и ТОСН.

В работе также использованы следующие материалы и реактивы: фотоотверждаемый клей ACRIFIX®1R 0192 и разбавитель ACRIFIX®ТС 0030 (Evonik Industries, Германия); фотоотверж-даемый клей Permabond UV630 (Permabond® Engineering Adhesives); стекло предметное (BioVitrum) размером 75×25 мм, толщиной 1 мм; стекла покровные (BioVitrum) размером 24×24 мм, толщи- ной 170 мкм; метакриловая кислота (99.9 %); натрия гидроксид (Ч); фтористоводородная (плавиковая) кислота (ХЧ); краситель флуоресцеин (ЧДА).

Оборудование, использованное в работе

В воздушном термостате (низкотемпературная лабораторная электропечь SNOL 58/350) проводили операции отжига и сушки.

При помощи ртутной лампы ДРШ-250 проводили отверждение клеевых составов.

На аналитических весах ТЕ 64 (Sartorius, Германия) с классом точности I (специальный), по ГОСТ 24104-2001, осуществляли взвешивание микрочипов при проведении испытаний на герметичность гравиметрическим методом и навесок для приготовлени растворов.

На оптическом микроскопе (Leica, Германия) с цифровой камерой Pike (Allied Vision, Германия) получали изображения поперечных срезов клеевого и сварного (химическая сварка) неразъемных соединений.

На лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SL (Leica, Германия) изучали распределение флуоресценции раствора с красителем в реакционной камере.

Методы контроля герметизации

Качество герметизации проверяли гравиметрическим методом [8] и методом оптической микроскопии. В первом случае критерием герметичности является сохранение массы введенной в реакционную камеру жидкости после имитации условий проведения ПЦР (термоциклирования): предварительный прогрев до 95 °С в течение 5 мин; затем 40 циклов нагрева-охлаждения — 95 °C в течение 20 с, 60 °C в течение 60 с. Температурный режим обеспечивали при помощи амплифика-тора (термоциклера) (Swift MaxPro, ESCO, Сингапур). Для измерения массы микрочиповых устройств использовали аналитические весы. Предел допускаемой погрешности в измеряемом интервале взвешивания составлял ±0.5 мг. Известно, что оргстекло, как и другие материалы, при хранении адсорбирует своей поверхностью влагу из окружающей среды, при этом масса его увеличивается. Поэтому убыль массы микрочипового устройства после термоциклирования может быть обусловлена не только испарением жидкости из реакционной камеры, а также десорбцией влаги с его поверхности. Поправка на влагопоглощение материала микрочипа составляет 0.2 % от массы пустого устройства [8]. В результате экспериментальных исследований был принят критерий, что мик-рочиповое устройство считается герметичным и выдержавшим испытание, если убыль его массы после термоциклирования по отношению к массе, введенной в реакционную камеру жидкости (с учетом поправки на влагопоглощение), — величина, обозначенная далее δ, не превышает 5 %.

Указанное значение получено следующим образом. На первом этапе для двух групп устройств — выдержавших и не выдержавших испытания на герметичность — строились две выборки значений δ ; для каждой из них были рассчитаны оценки математического ожидания и дисперсии. Полагали, что значения δ для обеих выборок удовлетворяли нормальному (гауссовому) закону распределения. Далее применили простейший пороговый алгоритм дискриминации: если измеренная величина δ не превосходила порогового значения Р , то устройство считалось герметичным, иначе — нет. При использовании такого алгоритма были возможны два типа ошибок дискриминации: ошибка первого рода — признание негерметичного устройства герметичным по формальному признаку ( δ ≤ Р ) с вероятностью α и ошибка второго рода — признание герметичного устройства негерметичным по формальному признаку ( δ >  Р ) с вероятностью β . Пороговое значение Р выбиралось по критерию минимизации суммарной вероятности ошибок ( α + β ). В нашем случае это значение оказалось равным 4.85 %. Так как сумма ( α + β ) имеет гладкий минимум, то из соображений удобства выбрали квазиоптимальное пороговое значение, округлив его до 5 %. При этом минимальная сумма ( α + β ) составила около 5.2 %. Таким образом, применение нашего алгоритма дискриминации приведет к ошибке примерно в одном случае из выборки 19 устройств.

На лазерном сканирующем конфокальном микроскопе TCS SL оценивали герметичность, изучая распределение флуоресценции раствора с красителем (10–5 М флуоресцеин в боратном буфере, рН = 9.18) на границе соединения реакционной камеры с герметизирующей пластиной. Критерием герметичности является отсутствие после термоциклирования следов распространения раствора красителя между пластинами микрочипового устройства.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Технология спекания

Для герметизации полимерных микрочиповых устройств широко применяются термическое связывание (или спекание), склеивание полимерными композициями, ламинирование, плазменная обработка, ультразвуковая сварка и др. [9]. В работе более подробно рассмотрены методы спекания, склеивания и химической сварки с помощью растворителей.

Для ПММА многообразие методов можно условно разделить на герметизацию при высоких, т. е. выше температуры стеклования (более 100 °С), и низких температурах (ПММА находится в стеклообразном состоянии). Процесс герметизации при повышенных температурах называется спеканием и заключается в нагревании и выдерживании соприкасающихся канализированной и защитной пластин при определенной температуре, называемой температурой спекания ( T C ). Качество получаемого соединения будет зависеть от скорости нагревания, температуры и длительности нагревания, давления и тщательности подготовки поверхностей пластин. Природа спекания обусловлена характером теплового движения частиц [10, 11].

Ранее при разработке технологии спекания микрочипов из ПММА за T C мы принимали самую низкую температуру, при которой образцы ПММА начинают деформироваться при выбранных давлении (2 кгс/см²) и времени спекания (100 мин). Для ПММА ТОСП^® она составила 120 °С [12]. В данной работе при тех же условиях была измерена T C для марки ACRYMA^®72. Она также составила 120 °С. Нагревания до этой температуры было достаточно для получения неразъемного соеди-

Рис. 1. Изображение сечения канала микрочипового устройства из ПММА ТОСП^® после спекания при различных температурах.

а — 100 °С; б — 130 °С [12]

нения хорошего качества. При этом граница раздела между канализированной и защитной пластинами не исчезала, а оставалась достаточно заметной, что является характерным признаком данного соединения (рис. 1). По-видимому, "в этом случае происходит только перемещение небольших сегментов макромолекул, т. е. микроброунов-ское движение. Вероятность перехода всей макромолекулы через границу контакта чрезвычайно мала" [10].

Метод спекания был использован при изготовлении микрочиповых устройств (9 шт.) для проведения жидкостной ПЦР. Устройство состояло из трех пластин марки ACRYMA®72 размером 24×24×1 мм. В средней пластине сверлением было выполнено сквозное отверстие диаметром 8 мм, в верхней (защитной) — два отверстия диаметром 1.7 мм. Процесс спекания проводили при следующем режиме: температура — 120 °С; удельное давление — 2 кгс/см2 и время спекания — 100 мин.

За время хранения микрочипов, изготовленных методом спекания, признаков старения или разрушения в области соединительного шва не наблюдается уже в течение трех лет.

Спекание полимерных материалов не требует такого высокого качества подготовки поверхности, как при спекании стекол, и является менее трудоемким. Достоинством метода является изготовление уже стерилизованных микроструктур, а также получение оптически прозрачного соединения. К недостаткам метода можно отнести получение неровного оплавленного дна реакционной камеры (по визуальным оценкам) за счет размягчения ПММА и диффузии на поверхность содержащегося в нем пластификатора. Существенным ограничением данной технологии является невозможность герметизации канализированных пластин со встроенными нетермостойкими функциональными элементами (например, содержащими химически "пришитый" акриламидный гель).

Технология склеивания

Одним из распространенных низкотемпературных способов соединения деталей является склеивание. Склеивание — это процесс получения неразъемного соединения деталей путем введения в технологический зазор между ними клеевой композиции, способной к отверждению. Прочность такого соединения обеспечивается за счет возникновения сил межмолекулярного взаимодействия или за счет образования химических связей между подложкой и клеем в процессе отверждения (адгезионная прочность), а также прочностью самого материала отвержденного клея (когезионная прочность) [10, 13]. Прочность клеевого соединения, как правило, не превышает 10÷20 МПа

• [14] . Характерным признаком клеевого соединения является наличие прослойки отвержденного клея, которая образует самостоятельную фазу.

При изготовлении микрочиповых устройств для проведения ПЦР в гелевой среде (ПЦР в геле) мы остановились на методе склеивания как наиболее технологичном и простом в реализации. Склеивание не требует применения высоких температур или давлений и является малочувствительным к присутствию на поверхности инородных частиц. При помощи специального оборудования (например, центрифуги) возможно формирование тонкой равномерной пленки клея заданной толщины. В зависимости от числа оборотов центрифуги и вязкости клеевого состава получают пленки толщиной до 1.5 мкм [15, 16]. Иногда перед склеиванием может понадобиться дополнительная обработка полимерных пластин, например снятие остаточных напряжений, очистка (обезжиривание), увеличение шероховатости поверхности (шлифовка) и пр. К недостаткам склеивания можно отнести возможность образования пустот и пузырей в области клеевого шва, а также риск засорения клеевым составом функциональных элементов микрочипового устройства.

В настоящее время известно большое количество разнообразных клеев для работы с полимерными материалами, которые производятся российскими и зарубежными компаниями. Однако требование отсутствия компонентов клея, влияющих на эффективность ПЦР, существенно ограничивает круг подходящих клеевых композиций. На основании анализа литературных данных [2, 3] и декларируемой производителем информации [17] для работы по герметизации микрочиповых устройств из ПММА был выбран однокомпонентный клей УФ-отверждения ACRIFIX® 1R 0192, представляющий собой прозрачный, вязкий раствор акрилового полимера. Фотоотверждение клея ACRIFIX® 1R 0192 происходит, по-видимому, по свободнорадикальному механизму. Под действием ультрафиолета присутствующие в клее фотоинициаторы распадаются на свободные радикалы. Далее основной компонент клея — молекулы с двойной связью С=С реагируют со свободными радикалами с образованием новых реакционноспособных радикалов. Реакция заканчивается образованием нейтральной макромолекулы полимера. Для уменьшения вязкости клеевого состава применяли разбавитель ACRIFIX®ТС0030 того же производителя.

Проведенные исследования подтвердили предположение об отсутствии ингибирования ПЦР выбранными для склеивания материалами — клеем ACRIFIX® 1R 0192 и разбавителем ACRIFIX®ТС0030 [8].

а

б

Рис. 2. Двухкамерные микрочиповые устройства для проведения ПЦР в геле с двумя вариантами исполнения защитных пластин (а) и (б).

Пояснения см. в тексте

Методом склеивания были герметизированы пластины двухкамерного микрочипового устройства (рис. 2) для проведения ПЦР. Нижняя пластина микрочипов представляет собой пластину ПММА ТОСП® размером 32×24 мм и толщиной 1 мм с двумя реакционными камерами диаметром 10 мм и глубиной 200 мкм, изготовленными методом лазерной абляции. Верхние пластины — ПММА ACRYMA®72 толщиной 1 мм и размером 11×13 мм (рис. 2, а) или 14×16 мм с двумя отверстиями диаметром 1 мм (рис. 2, б).

Технология склеивания включала следующие основные операции .

• 1.    Подготовка поверхности пластин устройства.

• 2.    Герметизация.

Верхние пластины промывали в мыльном растворе, затем в теплой дистиллированной воде и выдерживали при 80 °С в течение 1 ч в воздушном термостате (для сушки и для снятия внутренних напряжений). Нижние пластины промывали в дистиллированной воде и выдерживали в воздушном термостате при 80 °С в течение 2 ч.

Верхнюю пластину помещали на нижнюю и в образовавшийся технологический зазор при помощи дозатора вводили клеевой раствор (при комнатной температуре). Затем отверждали клеевой раствор под действием УФ-излучения в течение 20 мин при помощи ртутной лампы ДРШ-250. Для удаления следов растворителя из зоны клеевого шва и "приработки" клеевого соединения герметизированные устройства выдерживались сутки при комнатной температуре.

При помощи данной технологии герметизации была изготовлена партия микрочиповых устройств в количестве 140 шт., предназначенных для проведения ПЦР в геле. Реакционные камеры нижних пластин содержали слой высушенного акриламидного геля, химически (ковалентно) "пришитого" к поверхности ПММА по известной для стекла методике [18], адаптированной нами для полимерных микрочипов:

модификация поверхности [19] → силанизация → иммобилизация геля → стерилизация геля.

На стадии отверждения клеевого раствора под действием УФ-излучения гели в реакционных камерах накрывали масками.

Следует отметить, что при склеивании объем реакционной камеры увеличивается в соответствии с толщиной клеевого шва. Толщина полученного клеевого шва, измеренная с помощью микроскопа БИОЛАМ П-1, составила 40÷50 мкм при глубине реакционной камеры 200 мкм.

Использованный способ формирования клеевого слоя между канализированной и защитной пластинами позволяет обеспечить стерильные условия при герметизации микрочиповых устройств, содержащих в реакционных камерах акриламидный гель. К особенностям такого способа склеивания следует отнести необходимость подбора вязкости и вводимого объема клеевого раствора для того, чтобы он равномерно заполнил технологический зазор между пластинами за счет равновесия капиллярных сил и сил поверхностного натяжения, но не проникал в пространство реакционной камеры. Поэтому в ходе технологических работ по герметизации микрочипов мы выбрали клеевой раствор, состоящий из смеси клея ACRI-FIX® 1R 0192 и разбавителя ACRIFIX®ТС 0030, взятых в соотношении 3 : 4 (по объему). Срок хранения клеевого раствора — одна неделя (при комнатной температуре).

Режим термоциклирования при проведении ПЦР предполагает воздействие на клеевое соединение динамических нагрузок. Для таких условий принято полагать, что неразрушающими являются нагрузки, не превышающие 1–2 % от предельно допустимых [20]. Указанный производителем предел прочности на сдвиг для неотожженного клеевого соединения (клей ACRIFIX® 1R 0192/ПММА PLEXIGLAS®), составляет около 30 МПа [17]. Таким образом, можно принять, что при эксплуатации микрочипов допустимыми являются нагрузки, не превышающие 0.3 МПа (3 атм). При нагревании герметично заклеенных микрочипов (не заполненных жидкостью) от 20 до 95 °С происходит увеличение давления воздуха в реакционных камерах, которое, согласно расчету по уравнению состояния реальных газов, составляет 0.13 МПа (1.3 атм). Следовательно, расчетные эксплуатационные нагрузки не превышают допустимые, и можно ожидать, что предложенная технология герметизации пригодна для изготовления микрочипов из ПММА.

Следует иметь в виду, что микрочипы для ПЦР в геле в течение всего срока хранения (до одного года при температуре около +4 °С) и при проведении ПЦР находятся под воздействием воды и ее паров, что является дополнительным негативным фактором, влияющим на адгезионную прочность клеевого соединения. За время хранения микрочипов в холодильнике влага, содержащаяся в акриламидных гелях и в свободном пространстве реакционных камер над гелями, может конденсироваться в микропустотах и постепенно распространяться между слоем клея и пластинами микрочипа, образуя участки сплошной водной пленки [20]. Повышение температуры до 90–95 °С при проведении ПЦР помимо увеличения давления в реакционной камере может ускорить этот процесс, а также инициировать реакцию воды с функциональными группами в зоне клеевого шва, что в результате может привести к разгерметизации реакционных камер микрочипа и испарению ПЦР-смеси.

Десять микрочипов (из партии 140 шт.) были проверены на герметичность гравиметрическим методом после хранения в холодильнике от 2 недель до 4 месяцев. Убыль массы микрочипов после термоциклирования по отношению к массе введенной в реакционную камеру жидкости (с учетом поправки на влагопоглощение) не превысила 5 %, что свидетельствует о надежности клеевого соединения и пригодности разработанной технологии герметизации для изготовления микрочипов из ПММА.

Технология химической сварки растворителем

Существует разновидность способа получения неразъемного соединения полимерных материалов, которая по технологическим признакам напоминает склеивание, но отличается от него механизмом образования соединительного шва — это химическая сварка с помощью растворителей [10, 13]. Прочность такого сварного соединения достигается не только за счет действия межмолекулярных сил, но также за счет образования химических связей в зоне сварного шва. В отличие от спекания (рис. 1) и склеивания (рис. 3, а) в результате химической сварки наблюдается непрерывный структурный переход между соединяемыми материалами, т. е. межфазная граница раздела практически отсутствует (рис. 3, б).

Рис. 3. Поперечные срезы микрочипово-го устройства в области реакционной камеры.

а — при клеевом соединении; б — при сварном соединении (метод химической сварки метакриловой кислотой)

Для того чтобы реализовать метод химической сварки для герметизации микрочипов из ПММА в качестве растворителя была опробована метакриловая кислота СН 2 =С(СН 3 )СООН. Это соединение способно растворяться в поверхностном слое ПММА и делать его более пластичным, что должно приводить к понижению Т _р и увеличению скорости диффузии макромолекул полимера. В то же время метакриловая кислота способна полимеризоваться и образовывать свои полимерные цепочки в зоне соединительного шва, что должно улучшать качество получаемого соединения.

Технологический процесс сварки метакриловой кислотой включал следующие основные операции .

• 1.    Подготовка поверхности пластин устройства.

• 2.    Герметизация.

Полимерные пластины промывали в мыльном растворе, затем в теплой дистиллированной воде и высушивали при температуре 70–80 °С в воздушном термостате.

Помещали одну пластину на другую и в образовавшийся технологический зазор вводили метакриловую кислоту (99.9 %), затем — выдерживание при температуре 60 °С в течение 1 ч. Для удаления следов метакриловой кислоты и "приработки" сварного соединения герметизированные микрочипы выдерживали сутки при комнатной температуре.

При помощи данной технологии герметизации была изготовлена партия трехслойных микрочи-повых устройств (27 шт.) из ПММА ACRYMA®72, предназначенных для проведения жидкостной ПЦР. Устройство состояло из трех пластин марки ACRYMA®72 размером 24×24×1 мм. В средней пластине сверлением было выполнено сквозное отверстие диаметром 8 мм, в верхней (защитной) — два отверстия диаметром 1.7 мм.

Два микрочиповых устройства из этой партии были проверены на герметичность гравиметрическим методом и методом оптической микроскопии. Результаты испытаний свидетельствуют о том, что полученное по технологии химической сварки неразъемное соединение остается герметичным.

За время хранения микрочиповых устройств, изготовленных методом химической сварки, признаков старения или разрушения сварного шва не наблюдается уже в течение трех лет.

Метод химической сварки метакриловой кислотой подходит для соединения деталей из ПММА марки ACRYMA®72 с деталями из ПММА марок ТОСП® и ТОСН (пары

ACRYMA®72—ACRYMA®72;

ACRYMA®72—ТОСП®; ACRYMA®72—ТОСН).

Следует отметить простоту реализации данной технологии, поскольку свойства метакриловой кислоты дают возможность точно, аккуратно и быстро (менее минуты) заполнить технологический зазор между пластинами и осуществить герметизацию без приложения избыточного давления. Достоинством также является получение оптически прозрачного соединения.

Однако применение метакриловой кислоты для изготовления микрочипов ПЦР требует проведения исследований по изучению ее влияния на эффективность ПЦР. В отличие от спекания при химической сварке необходимо введение дополнительных стадий для стерилизации внутреннего пространства реакционной камеры.

В состав метакриловой кислоты входит карбоксильная группа, содержащая "сильно поляризованные положительно водородный атом и углеродный атом, которые являются электрофильными центрами и неподеленные электронные пары двух кислородных атомов, которые являются нуклеофильными центрами" [21]. Поэтому можно предположить, что помимо способности растворяться в поверхностном слое ПММА и образовывать свои полимерные цепочки метакриловая кислота может взаимодействовать с поверхностными группами силикатного (неорганического) стекла, далее — стекла, за счет образования межмолекулярных, в частности водородных связей.

Технология склеивания ПММА с неорганическим стеклом

Основным ограничением использования полимерных материалов при изготовлении устройств для ПЦР является достаточно низкий коэффициент теплопроводности (до 0.25 Вт·м-1·К-1) [22] по сравнению со стеклами (до 1.3 Вт·м-1·К-1) [23]. Применение стекол позволяет обеспечить высокоэффективный теплообмен при проведении ПЦР. Поэтому изготовление микрочиповых устройств, сочетающих достоинства данных конструкционных материалов является актуальной задачей. В работе были проведены исследования по получению неразъемного соединения ПММА/стекло при помощи метакриловой кислоты с целью изготовления гибридных устройств.

Путем введения метакриловой кислоты в технологический зазор между деталями и последующего отжига были изготовлены две заготовки реакционных камер, дно которых было сделано из стекла, а стенки из ПММА. Стеклянная пластина представляла собой предметное стекло (BioVitrum) размером 32×24×1 мм, полимерная — ПММА марки ACRYMA®72 размером 24×24×1 мм, в которой выполнено сквозное отверстие диаметром 8 мм. Для подготовки предметных стекол к склеиванию использовали хромовую смесь. В случае первой заготовки в технологический зазор вводили метакриловую кислоту с добавкой 0.05 % НFконц. Небольшое количество плавиковой кислоты было добавлено в метакриловую для разрыхления поверхностного слоя стекла и как следствие — увеличения площади и прочности соединения. Во втором случае стеклянную пластину обрабатывали метакриловой кислотой в течение 4 суток. Далее обе заготовки выдерживали при температуре 60 °С в течение часа.

После 2.5 месяцев хранения заготовок в холодильнике (при температуре 4–6 °С) и 4 месяцев — при комнатной температуре признаков нарушения контакта полимерной и стеклянной пластин не наблюдалось. Далее заготовки снова были помещены в холодильник и через 5 месяцев хранения были зафиксированы области расклеивания по периферии заготовок, составляющие около 20 % от площади "склейки" (соединяемой площади). Эти данные свидетельствуют о том, что метакриловая кислота взаимодействует как с приповерхностным слоем ПММА, так и с поверхностными группами стекла.

Вышеописанным способом было изготовлено несколько трехслойных гибридных микрочиповых устройств. В качестве нижней пластины использовано покровное стекло толщиной 170 мкм (BioVi-trum), которое обрабатывали метакриловой кислотой в течение суток. В средней пластине (ПММА ACRYMA®72) сверлением было выполнено сквозное отверстие диаметром 8 мм, в верхней (ПММА ACRYMA®72) — два отверстия диаметром 1.7 мм. Один из микрочипов был проверен на герметичность гравиметрическим методом. Убыль его массы после термоциклирования по отношению к массе введенного в реакционную камеру раствора не превысила 5 %, что соответствует данному показателю для полимерных устройств и свидетельствует о герметичности полученного соединения ПММА/стекло.

Технологические исследования показали следующее.

• 1.    В метакриловую кислоту желательно добавлять акриловый полимер, например клей ACRIFIX^® 1R 0192. При этом повышается вязкость клеевого раствора и формируется клеевая прослойка между стеклом и ПММА, что позволяет герметизировать пластины, уже содержащие химически "пришитые" акриламидные гели. Наилучшие результаты были достигнуты при использовании следующего клеевого состава: метакриловая кислота с добавкой 0.1 % HF конц и клея ACRI-FIX^® 1R 0192, взятые в объемном соотношении 3 : 4.

• 2.    При изготовлении микрочиповых устройств для ПЦР желательно использовать защитные пластины толщиной около 170 мкм, поскольку более

толстые стекла (толщиной 400÷450 мкм) трескаются, не выдерживая перепада температур при термоциклировании.

В результате для соединения ПММА со стеклом была предложена следующая технология склеивания.

• 1.    Подготовка поверхности пластин устройства.

• 2.    Герметизация.

Стеклянные пластины обрабатывали в 0.5 М KОН в течение суток; затем промывали в теплой дистиллированной воде и высушивали в эксикаторе. Полимерные пластины промывали в дистиллированной воде и выдерживали при 80 °С в течение 2 ч в воздушном термостате (для сушки и снятия внутренних напряжений).

Помещали одну пластину на другую и в образовавшийся технологический зазор вводили клеевой раствор (при комнатной температуре). Затем отверждали клеевой раствор под действием УФ-излучения в течение 60 мин при помощи ртутной лампы ДРШ-250. Далее — проводили отжиг при температуре 60 °С в течение 60 мин. Для удаления следов летучих веществ и "приработки" клеевого соединения герметизированные микрочипы выдерживали сутки при комнатной температуре.

В работе при помощи данной технологии были изготовлены шесть гибридных микрочиповых устройств, конструкция которых аналогична представленной на рис. 2, а. Поверхность полимерных пластин (ПММА ТОСП®) была обработана согласно описанной выше методике, адаптированной для химической "пришивки" акриламидного геля к поверхности ПММА (модификация поверхности → силанизация → иммобилизация геля → стерилизация геля). На стадии отверждения клеевого раствора под действием УФ-излучения гели в реакционных камерах накрывали защитными фильтрами. Верхние пластины размером 11×13 мм и толщиной 170 мкм были вырезаны стеклорезом из покровных стекол (BioVitrum).

Один из микрочипов был проверен на герметичность гравиметрическим методом. Убыль его массы после термоциклирования по отношению к массе введенного в реакционную камеру раствора не превысила 5 %. Проверка четырех устройств методом оптической микроскопии показала, что в процессе термоциклирования герметичность реакционных камер не нарушилась. Выдержавшие испытания микрочиповые устройства хранили при комнатной температуре. В этих условиях у двух из них признаков старения или разрушения клеевого соединения не наблюдается уже в течение двух лет.

Таким образом, с помощью метакриловой кислоты возможно получение неразъемного соединения ПММА/стекло, выдерживающего перепады температур от 60 до 95 °С. Для повышения прочности соединения ПММА/стекло необходимо увеличивать количество межмолекулярных взаимодействий между поверхностными группами стекла и карбоксильной группой метакриловой кислоты. Поэтому вместо обработки поверхности стекла в щелочи можно рекомендовать обработку кислородной плазмой или раствором "пиранья" (смесь 30 % раствора H2O2 и концентрированной H2SO4 в различных соотношениях).

Использование клея Permabond

В работе был также опробован еще один клей УФ-отверждения — Permabond UV630 (Permabond® Engineering Adhesives), представляющий собой многокомпонентную смесь различных полиакрилатов и полиметакрилатов. Это клей средней вязкости, имеющий адгезию к широкому кругу материалов — полимерам (в том числе к поликарбонату), стеклу и металлам. Сочетание таких свойств как прочность на сдвиг и эластичность делают его пригодным для склеивания материалов с различными коэффициентами теплового расширения. Диапазон рабочих температур составляет от –55 до 120 °С [24].

Исследования показали отсутствие ингибирования ПЦР данным клеевым составом [8]. Поэтому при помощи клея Permabond UV630, согласно описанным выше технологиям склеивания, были изготовлены два полимерных и шесть гибридных микрочиповых устройств. Отверждали клей в течение 20 мин при помощи ртутной лампы ДРШ-250. Один полимерный микрочип выдержал испытания на герметичность гравиметрическим методом после хранения в холодильнике в течение трех месяцев. Остальные устройства хранили в холодильнике: полимерный микрочип — более года, гибридные микрочипы — шесть месяцев. За это время признаков старения или разрушения клеевых соединений (ПММА ТОСП®) / (ПММА ACRYMA®72) и (ПММА ТОСП®) / стекло не появилось.

Таким образом, клей Permabond UV630 является подходящим и перспективным для герметизации структур в микрочиповых устройствах, в том числе содержащих встроенные пористые функциональные элементы (например, иммобилизованный акриламидный гель). С его помощью возможно изготовление как полимерных, так и гибридных микрочипов. Достоинством также является получение оптически прозрачного соединения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В статье рассмотрены способы неразъемного соединения пластин из ПММА при изготовлении микрочиповых устройств для проведения ПЦР: спекание, склеивание и химическая сварка растворителем. Реакционные камеры таких устройств оставались герметичными в условиях термоциклирования — циклического температурного режима проведения ПЦР. При длительном (от нескольких месяцев до 3 лет) хранении микрочипов признаков старения или разрушения в области соединительного шва не наблюдалось.

Метод спекания был использован при изготовлении микрочиповых устройств из ПММА марки ACRYMA®72 для проведения жидкостной ПЦР. На основе технологических исследований был выбран следующий режим: температура — 120 °С; удельное давление — 2 кгс/см2 и время спекания — 100 мин.

Разработанная технология склеивания включала подготовку поверхности пластин микрочипово-го устройства; введение клеевой смеси в технологический зазор между ними и отверждение клеевой смеси под действием УФ-излучения в течение 20 мин. Использовался клеевой раствор, состоящий из смеси клея ACRIFIX® 1R 0192 и разбавителя ACRIFIX®ТС 0030, взятых в соотношении 3 : 4 (по объему). Методом склеивания была изготовлена партия микрочиповых устройств в количестве 140 шт.

Для метода химической сварки в качестве растворителя была опробована метакриловая кислота. Этот метод подходит для соединения деталей из ПММА марки ACRYMA®72 с деталями из ПММА марок ТОСП® и ТОСН. Герметизацию пластин ПММА при изготовлении микрочипов проводили при температуре 60 °С в течение 1 ч (без приложения избыточного давления). Рассмотрены возможности соединения пластин из ПММА и неорганического стекла и предложены технологии герметизации гибридных микрочипов (ПММА/стекло).