Сравнение биологической эффективности импульсного и непрерывного нейтронного излучения с энергией 14 МэВ на культуре клеток мышиной меланомы В-16

В лучевой терапии злокачественных новообразований используются редко- и плотноио-низирующие излучения, генерируемые, как правило, источниками непрерывного действия. Для обеспечения локального противоопухолевого эффекта необходимо достичь высоких поглощённых доз облучения в мишени, однако, с повышением дозы начинают нарастать побочные эффекты действия излучений на нормальные ткани, попадающие в зону облучения. Одним из возможных способов уменьшения такого негативного действия ионизирующих излучений в настоящее время является разработка методов низкодозовой лучевой терапии с сохранением противоопухолевого эффекта, что становится возможным при использовании импульсно-периодического режима облучения с определёнными частотами повторения импульсов [4].

Представленные в литературе результаты исследований по сопоставлению биологического действия облучения в импульсном и непрерывном режимах на различные тест-системы, а также облучения в импульсном режиме с различной частотой импульсов в большинстве случаев противоречивы. Одни авторы наблюдали увеличение радиопоражаемости клеток с уменьшением частоты импульсов рентгеновского излучения [12, 13], в то время как по данным других авторов биологический эффект не зависел от частоты импульсов в широких её пределах [8, 15]. Повышение биологической эффективности пучка протонов (энергия 1000 МэВ) с уменьшением частоты импульсов с 45,9 до 4,5 с^-1 наблюдали в работе [3] в экспериментах по общему равномерному облучению животных. В работе [4] показано, что импульсно-периодическое рентгеновское излучение (ИПРИ) способно проявлять антипролиферативную активность в системе in vitro на культуре опухолевых клеток. При этом цитостатический эффект ИПРИ в значительной степени зависел от используемой частоты повторения импульсов («частотное окно» – 8, 10, 13, 16, 25 Гц), поглощённой дозы («дозовый коридор» от 0,003 до 0,1 Гр) и линии опухолевых клеток. Цитостатический эффект, отмеченный для ИПРИ в системе in vitro , сохранялся и при локаль-

Исаева Е . В . – ст. науч. сотр., к.б.н.; Бекетов Е . Е . – аспирант; Корякин С . Н . – вед. науч. сотр., к.б.н.; Ульяненко С . Е . * – зав. отделом, д.б.н.

ном облучении опухоли (карциномы легких Льюис) в системе in vivo [1]. При изучении дозовой зависимости выхода аберраций хромосом в культуре лимфоцитов человека при облучении нейтронами со средней энергией 0,7 МэВ в импульсном режиме в работе [7] не обнаружено достоверных различий в цитогенетическом эффекте при частоте импульсов 1 и 5 Гц, однако, авторы отметили его повышение при частоте 100 Гц. Также противоречивы и результаты исследований по сопоставлению биологического действия смешанного гамма-нейтронного излучения импульсного реактора БАРС-6 (средняя энергия нейтронов 1,44 МэВ), работающего в двух режимах: одиночный импульс длительностью ~ 65 мкс и непрерывное излучение длительностью 1 ч. В зависимости от используемой тест-системы отмечалась большая эффективность или импульсного режима облучения [6], или непрерывного [5], или авторы не наблюдали достоверных различий в действии обоих режимов облучения [2, 5, 6, 9, 10].

Из анализа литературных данных следует, что в настоящее время вопрос о биологическом действии импульсного ионизирующего излучения, и в частности импульсного нейтронного воздействия, далеко не решен. В связи с этим цель настоящей работы состояла в исследовании биологической эффективности импульсного нейтронного излучения с энергией 14 МэВ в зависимости от частоты импульсов (10, 50 и 75 Гц). Также интересовал вопрос, как соотносятся данные по выживаемости клеток млекопитающих, полученные при облучении импульсным нейтронным излучением, с результатами облучения в непрерывном режиме.

Материалы и методы

В качестве источников нейтронного излучения использовали импульсный генератор ИНГ-031 и генератор НГ-14 непрерывного действия, разработанные во ВНИИ автоматики им. Н.Л. Духова (Москва). Средний выход нейтронов из мишени с энергией ~ 14 МэВ, образующихся в результате реакции 3Н(d,n)4Не, составлял для ИНГ-031 6,6·109 н/с и для НГ-14 1,4·1010 н/с. Длительность импульса – 1 мкс, возможный диапазон изменения частоты следования импульсов от 1 до 100 Гц (для ИНГ-031). В экспериментах использовали частоты – 10, 50 и 75 Гц. Вклад сопутствующего гамма-излучения находился в пределах 10-17 %, в зависимости от расстояния до мишени. Для уменьшения вклада сопутствующего гамма-излучения в общую дозу облучения верхнюю чашку экранировали свинцовой пластиной толщиной 2 мм.

Недостатком работы генератора ИНГ-031 была нестабильность потока нейтронов во время облучения, довольно быстрый спад выхода нейтронов по мере проведения серии последовательных облучений и ограничение в длительности одного сеанса (15 мин при частоте импульсов 50 Гц). Поэтому для получения требуемых доз в заданном диапазоне от 0,5 до 5 Гр была применена схема облучения, представленная на рисунке 1. Опытные образцы облучали в чашках Петри диаметром 35 мм, которые располагали стопкой по 4-5 чашек. Расстояние от мишени генератора ИНГ-031 до дна верхней чашки в разных экспериментах составляло: 2,3, 2,5 и 2,8 см. Усреднённые по ряду опытов дозы облучения, мощности доз, дозы за импульс на одних и тех же расстояниях от мишени приведены в таблице 1.

Рис . 1. Схема облучения культуры клеток меланомы В-16 в монослое на ИНГ-031.

Таблица 1

Параметры нейтронного облучения клеток меланомы В -16 в монослое на генераторе ИНГ -031

Расстояние от мишени генератора , см	Среднее время облучения , с	Доза , Гр	Мощность дозы , Гр ·10-4/ с	Доза за импульс , Гр ·10-4
Частота 10 Гц
2,3		2,3	12,2	1,2
2,8	1890	1,9	10,1	1,0
3,3		1,4	7,4	0,7
3,8		1,1	5,8	0,6
Частота 50 Гц
2,3		4,6	51,1	1,0
2,8		3,4	37,7	0,8
3,3		2,7	30,0	0,6
3,8	900	2,2	24,4	0,5
4,5		1,7	18,9	0,4
5,5		1,2	13,3	0,3
6,5		0,7	7,7	0,2
Частота 75 Гц
2,5		3,3	68,8	0,9
3,5		2,0	41,6	0,6
4,8	480	1,3	27,1	0,4
5,3		1,0	20,8	0,3
5,3		0,9	18,8	0,3
6,3		0,8	16,7	0,2

На генераторе НГ-14 чашки с культурой клеток также облучали стопкой. Расстояние до мишени от дна верхней чашки в стопке составляло 4,6 см. Исследованный диапазон доз 0,6-4,9 Гр. Мощность дозы уменьшалась с 41,7·10-4 Гр/с на расстоянии от мишени 4,6 см (верхняя чашка) до 7,4·10-4 Гр/с на расстоянии 9,6 см (нижняя чашка). Длительность облучения составляла 14-20 мин.

Дозиметрию осуществляли с помощью «Измерителя импульсного потока нейтронов автоматизированного» (ИНПА), поставляемого вместе с генератором, а также дозиметров ДКС-101 и Unidos. Погрешность определения дозы составляла около 10 %.

В качестве экспериментальной биологической тест-системы использовали культуру клеток мышиной меланомы В-16, полученную из РОНЦ им. Н.Н. Блохина, приспособленную к выращиванию в монослое. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением антибиотиков

(канамицин 100 мг/мл), 10 % фетальной сыворотки в атмосфере, содержащей 5 % СО 2 , при температуре 37 ° С. Облучали культуру в поздней лог-фазе в монослое в чашках Петри (Corning, США) диаметром 35 мм при комнатной температуре. После облучения выживаемость клеток определяли по методу Puck T. и Marcus P. [14], модифицированному для наших условий. Для этого облучённые клетки снимали со дна чашек Петри раствором трипсина-ЭДТА, ресуспенди-ровали до получения одиночных клеток и подсчитывали в камере Горяева. Высевали (от 1000 до 100 000 клеток на флакон в зависимости от дозы облучения) в чашки Петри (Corning, США) диаметром 100 мм в среду RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной сыворотки и выдерживали в СО 2 -инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 8-11 дней до формирования видимых невооруженным глазом колоний. По окончании инкубации культуральную среду удаляли, колонии окрашивали 2 % раствором метиленового синего в 50 % этаноле по методике, описанной Guda K. et al. [11]. Подсчёт вели на счётчике Scan 100 (Interscience, Франция), учитывая колонии, содержащие 50 и более клеток. Фракцию клоногенных клеток выражали в процентах по отношению к высеянным. Полученные значения соотносили с выживаемостью в контроле.

Статистическую обработку результатов и определение параметров кривых доза-эффект осуществляли с помощью пакета программ «Origin 6.1». Аппроксимацию экспериментальных данных проводили по линейно-квадратичной модели:

- InS = aD + ро2, где S - доля выживших клеток; D - доза облучения, Гр; а, в - коэффициенты, отражающие вероятность образования летальных повреждений в треках одной или нескольких частиц.

Соответствие экспериментальных данных указанной модели оценивали с помощью критерия % ².

Результаты и обсуждение

Экспериментальные результаты зависимости клоногенной активности клеток меланомы В-16 от дозы и частоты импульсного нейтронного излучения представлены на рисунке 2 в виде кривых доза-эффект.

Рис . 2. Кривые доза-эффект для мышиной меланомы В-16, облучённой импульсным нейтронным излучением (14 МэВ) с частотой импульсов 10 Гц (кривая 1, квадраты), 50 Гц (кривая 2, круги) и 75 Гц (кривая 3, треугольники). Коэффициенты а кривых: 1) 0,76271 ± 0,03485;

2) 0,71867 ± 0,03527; 3) 0,79058 ± 0,04825.

Как следует из приведённых данных, эта зависимость носит линейный характер при всех исследованных частотах следования импульсов в указанном диапазоне доз (соответственно уравнение, описывающее линейную зависимость, принимает вид: - In S = a D ). Вследствие ограниченного выхода нейтронов генератора ИНГ-031 для кривой 10 Гц были получены данные в основном на начальном участке.

Используемая в наших экспериментах схема облучения, когда воздействию подвергается сразу стопка чашек, приводит к изменению мощности дозы в каждой последующей чашке. Однако, на одних и тех же расстояниях от мишени генератора, при разных частотах доза за импульс и, соответственно, мощность дозы в импульсе имеют близкие значения (табл. 1). Таким образом, одна и та же доза может быть «набрана» разным количеством импульсов, и конечный эффект облучения клеток зависит от частоты, а не от мощности дозы. Сопоставление между собой данных по выживаемости клеток меланомы В-16, полученных после воздействия при частотах 10, 50 и 75 Гц, не выявило значимых отличий между ними, из чего следует заключение: изменение частоты следования импульсов нейтронного излучения как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения от 50 Гц (базовой частоты для ИНГ-031) не приводит к уменьшению или увеличению количества выживших клеток. Эффект облучения в данном случае не зависит от частоты импульсов. Этот вывод совпадает с данными работы [7], где исследовали дозовую зависимость выхода аберраций хромосом в культуре лимфоцитов человека при импульсном нейтронном облучении с частотой 1 и 5 Гц. Возможно, биологический эффект облучения определяется как раз тем, какие именно частоты следования импульсов применяются. Так, в работах [1, 4] при исследовании антипролиферативного действия ИПРИ на опухолевые клетки, показано, что эффект проявлялся только при определённых частотах и в определённом диапазоне доз. Одновременно авторы пришли к выводу, что фактор длительности импульсов в проведённых экспериментах существенным не является. Возможные механизмы анти-пролиферативного действия ИПРИ на опухолевые клетки связаны, по мнению авторов, с индукцией активных форм кислорода, выходом цитохрома С из митохондрий, активацией экспрессии р53 и, в конечном счёте, с индукцией процесса апоптоза. Поскольку как редко-, так и плотноио-низирующие излучения инициируют в клетках одни и те же первичные физико-химические процессы, указанные механизмы могут иметь место и при действии нейтронного излучения. Вопрос заключается в том, какой дозовый и частотный диапазон следует исследовать в этом случае.

Следующим этапом наших исследований было сравнение биологической эффективности импульсного нейтронного излучения генератора ИНГ-031 при частоте 50 Гц с эффективностью непрерывного нейтронного излучения генератора НГ-14. Результаты представлены на рисунке 3.

Доза, Гр

Рис . 3. Кривые доза-эффект клоногенной активности клеток мышиной меланомы В-16, облучённой импульсным (ИНГ-031, 50 Гц) (круги) и непрерывным (НГ-14) (треугольники) нейтронным излучением с энергией 14 МэВ.

Как видно из рисунка, кривые доза-эффект, построенные на основе данных, полученных в ряде экспериментов на двух установках, в исследованном диапазоне доз имеют линейный характер с одинаковыми коэффициентами α , равными 0,769 ± 0,013 и 0,771 ± 0,014 для НГ-14 и ИНГ-031 соответственно. Обычно различия в действии излучения в импульсном и непрерывном режимах связывают с различиями в мощности дозы. Действительно, особенностью импульсного режима облучения является то, что в момент прохождения импульса мощность дозы может достигать очень высоких значений. Например, в проведённых экспериментах на ИНГ-031 она доходила до 1,2·10² Гр/с в импульсе, в то время как минимальная мощность дозы для НГ-14 (непрерывный режим) составляла всего 7,4·10^-4 Гр/с. Однако нами по тесту клоногенной активности клеток мышиной меланомы В-16 не обнаружено различий между облучением в импульсном и непрерывном режимах в указанном дозовом диапазоне.

Заключение

Таким образом, в проведённых нами исследованиях не выявлено различий в биологической эффективности импульсного нейтронного излучения с энергией 14 МэВ при различной частоте следования импульсов (10, 50 и 75 Гц). Возможно, для выявления закономерностей, характерных, по данным других авторов, для редкоионизирующих излучений, требуется исследовать другой дозовый или частотный диапазон. Также по тесту клоногенной активности клеток мышиной меланомы В-16 не обнаружено эффекта мощности дозы для нейтронного излучения с энергией 14 МэВ. Это позволяет нам в последующем использовать обе установки как взаимозаменяемые при исследовании одновременного действия гамма- и нейтронного излучений.