Сравнение иммуногистохимических тестов в рамках исследования CLOVER Российского общества клинической онкологии

Введение. Целью исследования CLOVER, проведенного Российским обществом клинической онкологии, было попарное сравнение трех валидированныхиммуногистохимических (ИГХ) тестов PD-L1 (Ventana SP142, Ventana SP263, Dako 22C3) на одной и той же популяции пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ). Данное исследование — это первое крупное росийское сравнительное исследование по оценке определения уровней экспрессии PD-L1 методами иммуногистохимии.

Материалы и методы. Работа проведена на 473 образцах НМРЛ, полученных из Биобанка. Иммуногистохимическое исследование проведено с использованием 3 клонов антител. Четыре подготовленных патологоанатома независимо оценивали процентное содержание положительно окрашенных опухолевых клеток (ОК) и иммунных клеток (ИК). Для оценки корреляции ОК и ИК между различными анализами и прогностических свойств одного теста для другого был проведен конкордантный анализ.

Результаты. Число PD-L1-позитивных клеток (1 % и более) было выше среди ИК по сравнению с ОК во всех трех иммуногистохимических исследованиях. Коэффициенты корреляции Пирсона (PCC) для ОК составили 0,71, 0,87 и 0,75 между 22C3/SP142, 22C3/SP263 и SP263/SP142 соответственно. Значения PCC для ИК составили 0,45, 0,61 и 0,68 для тех же пар. Было получено высокое совпадение положительных и отрицательных результатов (>91 %) между окрашиванием, полученным с антителами 22C3 и SP263 для иммуноонкологических препаратов в 1 линии.

Выводы. Наиболее высокая корреляция ИГХ анализов была получена при попарном сравнении 22C3 и SP263. Клон 22C3 можно рассматривать в качестве замены SP263 при лечении НМРЛ в первой линии. Клон SP142 показал более слабую экспрессию в ОК и ИК по сравнению с двумя другими анализами у пациентов с плоскоклеточным раком.

Пембролизумаб, анти-PD-1 гуманизированное антитело, рекомендуется в качестве препарата первой линии для пациентов с метастатическим НМРЛ с уровнем экспрессии PD-L1 более 50%, выявляемым иммуногистохимическим (ИГХ) методом с диагностическим антителом 22C3 (Agilent) [2,3]. Недавно пембролизумаб был одобрен к применению в качестве препарата первой линии для

СРАВНЕНИЕ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ В РАМКАХ ИССЛЕДОВАНИЯ CLOVER РОССИЙСКОГО ОБЩЕСТВА КЛИНИЧЕСКОЙ ОНКОЛОГИИ лечения метастатического НМРЛ в комбинации с пеметрек-седом и карбоплатином независимо от экспрессии PD-L1 [4] или в качестве препарата второй линии для пациентов с уровнем экспрессии PD-L1≥1 % [5].

Атезолизумаб, анти-PD-L1 гуманизированное антитело, одобрен в комбинации с химиотерапией и бевацизумабом в качестве терапии первой линии для пациентов с метастатическим НМРЛ независимо от уровня экспрессии PD-L1 [6]. Тестирование PD-L1 в данном случае не требуется, но оно может давать полезную информацию [7]. В исследовании OAK пациенты с высокой экспрессией PD-L1 имели наибольший выигрыш от атезолизумаба по сравнению с доцетакселом [8]. Высокий уровень экспрессии определяли как экспрессию PD-L1 в 50% и более опухолевых клеток (ОК) и в 10% и более опухолевых инфильтрирующих иммунных клеток (ИК) с использованием диагностического антитела SP142 (Ventana Medical Systems).

Ниволумаб — анти-PD-1 антитело — показан при использовании в качестве последующей терапии у всех пациентов с НМРЛ независимо от уровня экспрессии PD-L1 [9]. Дурвалумаб, анти-PD-L1 антитело, одобрен в качестве консолидирующей терапии для пациентов с нерезекта-бельным НМРЛ III стадии, которые не прогрессировали после 2 или более циклов окончательной одновременной химиолучевой терапии на основе платины [10]. Преимущество без прогрессирования выживаемости при применении дурвалумаба наблюдалось независимо от статуса PD-L1 (<25% или ≥25% позитивных опухолевых клеток), окрашенных диагностическим антителом SP263 (Ventana Medical Systems) до химиолучевой терапии).

Оценка экспрессии PD-L1 в опухолях легкого применяется в качестве биомаркера чувствительности к ингибиторам иммунных контрольных точек, но ее практическое использование оставляет еще много вопросов и проблем как для онкологов, так и для патологов. Так, для определения PD-L1 статуса опухоли и прогнозирования ее ответа на иммунотерапию в клинических исследованиях и рутинной практике используются различные антитела, методы детекции, инструментальные платформы, методы интерпретации и значения отсечения для каждого антитела. Однако патологоанатомические отделения в настоящее время не всегда располагают всеми автоматизированными платформами и реагентами для различных диагностических исследований in vitro. Кроме того, выявление экспрессии PD-L1 в НМРЛ проводится после молекулярного тестирования (EGFR, ALK, ROS1), что может повлиять на длительность диагностики и ее стоимость. Поэтому актуальным является вопрос о возможности замены одного диагностикума другим, а также клиническая значимость результатов, получаемых с использованием разных клонов антител.

Целью исследования «CLOVER», проведенного Российским обществом клинической онкологии (RUSSCO), было попарное сравнение трехвалидированных ИГХ тестов PDL1 (22C3, SP142 и SP263) на одной и той же популяции пациентов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования биобанк «RUSSCO» предоставил 500 архивных образцов НМРЛ (фиксированные формалином и залитые в парафин блоки). Время хранения блока составляло от 0,5 до 1 года. Четыреста семьдесят три образца содержали достаточно материала для анализа (27 были исключены из окончательного анализа, поскольку они не соответствовали требованиям к образцам для ИГХ). Пациенты были преимущественно мужского пола (68%) со средним возрастом 61,3 года (диапазон 28–85 лет). Образцы взяты у пациентов с НМРЛ I–IV стадии. Согласно классификации TNM, опухоли T1, Т2, Т3 и Т4 наблюдались у 78 (16,5%), 137 (29,0%), 63 (13,3%), и 195 (41,2%) пациентов, соответственно. Метастазы в лимфатических узлах были обнаружены у 353 (75%) пациентов; у 236 (50%) больных имелись отдаленные метастазы. Образцы НМРЛ имели положительный EGFR у 81 пациента (17%), у 37 (8%) зарегистрирован положительный ALK и у 91 (19%) — вариант плоскоклеточного рака. Ни один из больных не получал лучевой или системной терапии до хирургического лечения.

С каждого блока НМРЛ были подготовлены 4 последовательных среза для проведения исследования с 3 антителами и реагентом негативного контроля. Для контроля протокола ИГХ исследования использовались контрольные клеточные линии и внутрилабораторные тканевые позитивные контроли (ткани миндалины и плаценты). Срезы (1419 стекол) окрашивали анти-PD-L1 антителами, аналогично клиническим испытаниям препаратов: пембролизумаб (клон 22C3; Agilent), атезолизумаб (клон SP142; Ventana Medical Systems), дурвалумаб (клон SP263; Ventana Medical Systems) [3,8,10]. Исследование проводилось в автоматизированных ИГХ стейнерах с использованием оптимизированного закрытого протокола, предоставленного производителем. Клон 22С3 был протестирован на автостейнере DakoLink 48 (Agilent), клоны SP142 и SP263 — на стейнере Ventana Bench Mark ULTRA (Ventana Medical Systems). Четыре подготовленных патологоанатома, сертифицированные Ventana/Roche и Dako/Agilent для интерпретации соответствующих анализов, независимо оценивали процентное содержание позитивных ОК и ИК с любой интенсивностью окрашивания. В случае расхождения мнений при интерпретации результатов принималось консенсусное решение.

АНАЛИЗ ДАННЫХ

Мы оценивали корреляции между результатами различных анализов, определяющих экспрессию PD-L1 в ОК и ИК. Для оценки вероятности согласия или несогласия между каждой парой тестов были проведены четыре попарных сравнения относительных частот двух тестов, указывающих на положительное или отрицательное окрашивание. Была оценена условная вероятность одного теста, указывающего на положительное или отрицательное окрашивание или экспрессию РНК, с учетом результата каждого другого теста.

СРАВНЕНИЕ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ В РАМКАХ ИССЛЕДОВАНИЯ CLOVER РОССИЙСКОГО ОБЩЕСТВА КЛИНИЧЕСКОЙ ОНКОЛОГИИ

Были использованы следующие критерии оценки: для первой линии лечения НМРЛ показатель TPS (процент жизнеспособных опухолевых клеток с частичным или полным окрашиванием мембраны относительно всех жизнеспособных опухолевых клеток, присутствующих в образце) ≥50% для 22C3, ОК или ИК ≥5% для SP142, ОК ≥25% для SP263, а для второй линии лечения TPS ≥1% для 22C3, ОК ≥50% или ИК ≥10% для SP142, и ОК ≥25% для SP263 (табл. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Наличие позитивной реакции со всеми антителами к PD-L1 отмечалось как в ОК, так и в ИК. Процент PD-L1-позитив-ных клеток (1% и более) был выше для ИК, чем для ОК во всех трех анализах (54% против 39% для 22C3, 49% против 21 % для SP142 и 69 % против 51% для SP263). Результаты окрашивания варьировали для ИК и ОК при использовании SP142 по сравнению с другими клонами. Для каждого из этих ИГХ маркеров было проведено также и сравнение по границам отсечения в 10%, 25% и 50% PD-L1-позитивных клеток среди ОК и ИК. При пограничном значении положительного окрашивания в 10% ОК наибольшая доля положительных образцов наблюдалась при использовании антител 22С3 (21 %) и SP263 (20 %), тогда как окрашивание антителом SP142 выявило только 8% образцов, содержащих PD-L1-по-ложительные ОК. Для более высоких отсечек (25% и 50%) были получены аналогичные результаты. При отсечении позитивного результата по 25% ОК антитела 22C3 и SP263 показали, что 16% и 15% образцов имели положительный статус, соответственно. Антитело SP142 окрашивало только 5% образцов. Окрашивание 22С3 и SP263 при точке отсечения 50% ОК показало позитивный PD-L1 статус у 12% и 10% пациентов, соответственно, тогда как окрашивание SP142 выявило 3% PD-L1-позитивных образцов.

Наибольшая доля образцов с PD-L1-положительным окрашиванием ИК с использованием порогового значения 10% наблюдалась при использовании антител 22C3 (11 %) и SP263 (9%). Антитело SP142 обнаружило 4% позитивных образцов по этому критерию. Использование более высоких отсечек резко уменьшило долю образцов с наличием позитивных иммунных клеток: при отсечке 25% — только 1,1% (22C3), 0,6% (SP142) и 0,8% (SP263). Дальнейшее увеличение величины отсечки привело к еще большему снижению доли положительных образцов по окрашиванию ИК (0%–0,2%).

Для оценки результатов ИГХ исследования по окрашиванию ОК и ИК различными тестами был проведен корреляционный анализ. Коэффициенты корреляции Пирсона (PCC) для ОК составили 0,71, 0,87 и 0,75 между 22C3/SP142, 22C3/SP263 и SP263/SP142, соответственно. Значения PCC для ИК составили 0,45, 0,61 и 0,68 для тех же пар. Низкая корреляция наблюдалась между ПЦР-тестом и любым из ИГХ анализов для ОК и ИК. Например, значения PCC между PCR и 22C3 для TC и IC составили 0,36 и 0,14, соответственно.

Таблица 1. Точки отсечения для 22С3, SP142, SP263 для первой и второй линий иммунотерапии

Линии /препарата	22C3	SP142		SP263
	TPS	ОК или ИК		ОК
Первая	≥50%	≥5%	≥5%	≥25%
Вторая	≥1%	≥50%	≥10%	≥25%

TPS — Tumor Proportion Score, ОК — опухолевые клетки, ИК –им-мунные клетки.

Таблица 2. Экспрессия PDL1 в опухолях с различным гистологическим вариантом и EGFR и ALK статусом

ALK-EGFR-статус	22C3		SP142		SP263
	ОК≥1%	ИК≥1%	ОК≥1%	ИК≥1%	ОК≥1%	ИК≥1%
EGFR -позитивный	31/81 (38%)	39/81 (48%)	19/81 (23%)	47/81 (58%)	45/81 (56%)	60/81 (74%)
EGFR -негативный	153/392 (39%)	217/392 (55%)	82/392 (21%)	187/392 (48%)	196/392 (50%)	264/392 (67%)
ALK-позитивный	17/37 (46%)	12/37 (32%)	13/37 (35%)	14/37 (38%)	17/37 (46%)	12/37 (32%)
ALK-негативный	106/335 (32%)	154/335 (46%)	51/335 (15%)	133/335 (40%)	105/335 (31%)	154/335 (46%)
Плоскоклеточный рак	42/91 (46%)	48/91 (53%)	18/91 (20%)	30/91 (33%)	57/91 (63%)	69/91 (76%)

Таблица 3. Негативное и позитивное процентное согласование между различными ИГХ тестами в первой и второй линиях

Вероятность негативного теста В при негативном тесте A
Тест A	Тест В
	SP142		SP263		22C3
	First-line	Second-line	First-line	Second-line	First-line	Second-line
SP142	-	-	92%	85%	97%	65%
SP263	91%	98%	-	-	99%	76%
22C3	88%	99%	91%	99%	-	—
Вероятность позитивного теста B при позитивном тесте A
SP142	-	-	65%	76%	48%	94%
SP263	68%	28%	-	-	57%	98%
22C3	82%	17%	93%	49%	-	—

Экспрессия PD-L1 выявлялась у пациентов с аденокарциномой с различным статусом драйверных мутаций и с плоскоклеточным раком (табл. 2) Антитела 22C3 и SP263 показали более высокую экспрессию на ОК и ИК по сравнению с двумя другими тестами.

Анализ совпадения результатов ИГХ исследования с разными клонами антител показал высокую корреляцию результатов для клонов 22С3 и SP263 для назначения лечения в первой линии — более 91%, как для положительных, так и для отрицательных результатов (табл. 3).

СРАВНЕНИЕ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ В РАМКАХ ИССЛЕДОВАНИЯ CLOVER РОССИЙСКОГО ОБЩЕСТВА КЛИНИЧЕСКОЙ ОНКОЛОГИИ

ОБСУЖДЕНИЕ

CLOVER — одно из крупнейших гармонизирующих исследований, проведенное для установления степени аналитической согласованности между тремя валидированными диагностическими ИГХ тестами PD-L1, которые использовались в рандомизированных клинических испытаниях ингибиторов контрольных точек у пациентов с НМРЛ. Взаимозаменяемые ИГХ анализы могут облегчить оценку экспрессии белка в рутинной клинической практике и способствовать уменьшению времени проведения тестирования [11,12].

При сравнении результатов ИГХ анализов наиболее согласованные данные были получены при попарном сравнении 22C3 и SP263. В соответствии с предыдущими исследованиями [14–17] SP142 показал стабильно более низкие результаты, чем два других анализа. Таким образом, 22C3 можно рассматривать в качестве замены SP263 при необходимости тестирования в первой линии. Была получена высокая корреляция между окрашиванием 22C3 и SP263 с высоким PCC 0,87 для оценки ОК. Результаты проекта по сопоставимости PD-L1 ИГХ показали, что анализы 22C3 и SP263 дают сопоставимые аналитические результаты для оценки экспрессии PDL1 на ОК по коэффициентам корреляции [14]. В нашем исследовании положительное процентное согласие между двумя анализами составило 93 %, а отрицательное процентное согласие — 91%. Эти данные совпадают с данными исследования Ratcliffe et al. [15], обнаруживших, что SP263 может рассматриваться в качестве замены 22C3 (процентное положительное и отрицательное согласие — от 86% до 98,8%), расширяя показания для анализа SP263 до идентификации пациентов, имеющих показания для назначения пембролизума-ба в первой линии. Однако в нашем исследовании было выявлено только 57% положительных 22C3 в случаях с положительным SP263. Поэтому необходимо проявлять осторожность при рассмотрении возможной замены 22С3 на SP263 во всех лучаях тестирования. Тем не менее, мы можем предположить, что если пациент отрицателен по SP263 или SP142 в первой линии лечения, повторное тестирование другими тестами не является строго необходимым, это основано на высоком согласии данных анализов (в диапазоне от 91% до 97%) в нашем исследовании. Как правило, положительное совпадение между тремя анализами ИГХ (в диапазоне от 17% до 98%) варьировало больше, чем отрицательное процентное согласие (в диапазоне от 85% до 99%), согласно пороговому значению, используемому для сравнительных анализов. Hendry et al. получили аналогичные результаты [16]. Все три анализа (22C3, SP142 и SP263) дали высокое совпадение для отрицательных результатов, но для положительных результатов корреляция была низкой.

Мы считаем, что для назначения иммуноонкологи-ческих препаратов во 2 линии в случае положительных анализов SP142 или SP263 повторное тестирование по 22C3 может не проводиться. Почти все случаи, которые были положительными на платформе Ventana (94–98%), также были положительными и на платформе Dako. По той же причине повторное тестирование первоначально 22С3-отрицательных образцов по SP142 или SP263 также может не потребоваться (попарное согласие между всеми парами тестов составило 99%).

Экспрессия PD-L1 в ОК у пациентов с EGFR-негативным и EGFR-позитивным НМРЛ была очень сходной независимо от метода оценки. Напротив, более значительные различия в экспрессии PD-L1 были обнаружены в ИК. Пациенты с ALK-позитивным раком легких чаще экспрессировали PD-L1 в ОК, чем пациенты без ALK-перестроек, однако малая выборка не позволяет сделать однозначных выводов. Клон SP142 показал более слабую экспрессию в ОК и ИК по сравнению с двумя другими анализами у пациентов с плоскоклеточным раком. В рамках исследования CLOVER проводился также сравнительный анализ применения ПЦР для определения уровня эксперссии PD-L1, который показал низкую корреляцию ПЦР и ИГХ, в связи с чем определение экспрессии PD-L1 в рутинной практике надо проводить только ИГХ маркерами [18].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование CLOVER демонстрирует, что при сравнении данных ИГХ анализов наиболее согласованные результаты были получены при попарном сравнении 22C3 и SP263. В соответствии с предыдущими исследованиями, SP142 показал стабильно более низкие результаты, чем два других анализа. Мы предполагаем, что анализ 22C3 может предсказать тот же результат (положительный или отрицательный) анализа SP263 у пациентов в терапии первой линии ингибиторами контрольных точек. Пациенты, классифицированные как отрицательные по анализу с SP263 или SP142 с использованием соответствующего правила отсечения для лечения первой линии, с высокой вероятностью будут классифицированы как отрицательные любым другим тестом. У пациентов с положительным SP263 и SP142 или отрицательным 22C3 повторное тестирование во второй линии лечения не является необходимым. Новые клинические исследования могут внести коррективы в существующие сейчас значения точек отсечения для различных диагностикумов и в критерии оценки.