Сравнение кинетических свойств различных циклодекстринглюканотрансфераз

Циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТаза, КФ 2.4.1.19) – фермент, катализирующий реакции межмолекулярного трансгликозилирования, в своей сумме приводящие к деполимеризации крахмала и образованию циклодекстринов (ЦД) – нередуцирующих макроциклических олигосахаридов, широко используемых в пищевой промышленности, фармацевтике, косметике, органическом синтезе [1].

Наиболее распространены и известны, альфа-( a ), бета-( β ) и гамма-( γ ) ЦД, молекулы которых состоят из 6, 7 и 8 остатков D-глюкопиранозы, связанных a -1→4-D связями. При действии ЦГТазы на крахмал в реакционной смеси одновременно образуются и накапливаются все три гомолога, ингибирующие действие фермента.

В зависимости от того, какой продукт доминирует в продуктах конверсии, различают ( a )-, ( β )- и ( γ )-ЦГТазы, природа которых в свою очередь зависит от генетическо-видовых особенностей штамма-продуцента.

Не смотря на об илие публикаций о выделении новых бактерий, способных к синтезу ЦГТаз, накопленный материал зачастую оторван от современных таксономических описаний, названия изолятов бактерий не соответствуют действительности, а сами публикации фактически лишены смысла. Филогенетически изучены лишь единичные штаммы аэробных спорообразующих бактерий, таких как Paenibacillus macerans [2], P.illinoisensis [10], P.graminis [19], P.stellifer [17], P. campinasensis [20], Bacillus agaradhaerens [14]. Единичные продуценты позиционированы на физиологобиохимическом уровне на уровне родов Klebsiella [9].

Несмотря на перечисленные факты, даже в последних обзорах [16, 18], посвященных сравнительному описанию продуцентов ЦД, в качестве основной родовой группы продолжает фигурировать род Bacillus, Cohn 1872.

Практически не имеется работ, в которых бы в рамках одной лаборатории проводилось сравнение свойств нескольких ЦГТаз бактерий различных видовых групп, прошедших филогенетическую идентификацию. Целью настоящего исследования является восполнение пробелов в данной тематике.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использовали лиофильно высушенные препараты циклодекстринглюканотрансфераз продуцентов из коллекции лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН: Paenibacillus ehimensis ВКМB-2680D (IB-739), P.illinoisensis IB-1087, P.campinasensis IB-417, P.macerans IB-14 (IB-1053).

Выращивание бактерий Paenibacillus ehimensis осуществляли в 250 мл качалочных колбах содержащих 50 мл среды, при скорости 180 об/мин при 37÷39⁰С в течение 68÷72 ч, на среде, содержащей (в граммах): крахмал – 10,0; пептон – 4,0; дрожжевой экстракт – 5,0; КH 2 PO 4 – 1,0; СaСО 3 – 1,0; дистиллированную воду до 1000 мл, при стартовых рН 7,0-7,2.

Наработку ЦГТазы P.illinoisensis IB-1087 проводили в вышеописанных условиях на среде K1, содержащей (в граммах): крахмал – 10,0; пептон – 5,0; дрожжевой экстракт – 5,0; КH 2 PO 4 – 2,0; Na 2 HPO 4 – 2,0; дистиллированную воду до 1000 мл, при стартовых рН 7,2^7,4.

Наработку ЦГТазы P.campinasensis IB-417 проводили на среде К1 с добавлением 0,8÷1,0% Na₂CO₃, при стартовых рН 9,2^9,8.

Наработку препарата ЦГТазы P.macerans IB-I4 проводили на среде, содержащей (в граммах): крахмал – 10,0; пептон – 3,0; дрожжевой экстракт – 3,0; кукурузный экстракт – 3,0; (NH 4 ) 2 SO 4 – 0,2; CaCO 3 – 1,0; дистиллированную воду до 1000 мл, при стартовых рН 7,4^7,8.

ЦГТазную активность растворов и препаратов измеряли фенолфталеиновым методом [3], используя для разбавления фермента 50 мМ ацетатный буфер рН 6,0÷6,1, содержащий 10 мМ CaCl 2 . За 1 единицу активности принимали количество ЦГТазы, катализирующее образование 1 мкМ в -ЦД в течение 1 мин при 40 0 С.

Для выделения ЦГТазы из культуральной жидкости бактериальные клетки отделяли центрифугированием при 6000 мин-1 в течение 30 мин, фильтрат культуральной жидкости концентрировали методом ультрафильтрации на полых волокнах ВПУ-50. Для получения сухого не очищенного препарата концентрат подвергали лиофильной сушке в аппарате «ИНЕЙ-6».

Аналитическое определение специфичности ЦГТаз осуществляли следующим методом. Пробы (5 мл) реакционной смеси, состоящей из клейсте-ризованного картофельного крахмала в 50 мМ ацетатном буфере (рН 6,0), ЦГТазы и 10 мМ CaCl 2 , помещали в биологический термостат и выдерживали при 40⁰С в течение 24 часов. По истечении указанного интервала времени, из пробирок извлекали по 900 мкл образцов, которые помещали в 2,0 мл пробирки Эппендорф. В каждую из проб вносили по 90 мкл 10%-ного раствора ксилозы, игравшей роль внутреннего стандарта. После завершения указанных манипуляций в пробирки дозировали по 990 мкл ацетонитрила ОСЧ для хроматографии и отделяли образовавшийся осадок крахмала центрифугированием при 8000 мин^-1 в течение 10 минут. Порции супернатанта, соответствующие условиям реакции, анализировали с помощью ВЭЖХ на колонке «SEPARON-NH 2 »-5мкм (3х150 мм), используя в качестве элюента смесь ацетонитрил – вода в объемном соотношении 63:37. Подачу растворителя осуществляли насосом НРР-5001 со скоростью 0,7 мл/мин, а в качестве детектора использовали рефрактометр RIDK-102. Регистрацию и оцифровку аналогового сигнала, последующую обработку хроматограмм проводили с помощью программно-вычислительного комплекса «Мультихром 1.59». Калибровку прибора осуществляли методом внутреннего стандарта, используя индивидуальные ЦД производства «Wacker Chemie» (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для получения ферментных препаратов использованы культуры из коллекции лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН Paenibacillus illinoisensis (IB-1087), P.ehimensis ВКМ B-2680D (IB-739), P.macerans (IB-1053), P.campinasensis (IB-417). Три первых штамма были выделены из почвы с помощью аэробной и анаэробной накопительной среды на основе растворов 0,5% β -циклодекстрина [4, 5]. Алкалотоле-рантный штамм P.campinasensis IB-417 обнаружен в процессе скрининга продуцентов щелочных бактериальных целлюлаз на щелочной элективной среде, содержавшей в своем составе 0,5% КМЦ-Na и 1% Na 2 CO 3 (рН=10,0÷11,0).

Способность к синтезу ЦД, была обнаружена лишь после выполнения 16S рРНК анализа и обнаружения близкого сходства прочитанной последовательности гена с таковыми, описанными ранее бразильскими авторами у культур P.campinasensis

JCM11200 (№ NCBI=AB073187) и P.campinasensis BL11 (DQ232773) [7-8; 20].

Для наработки образцов ферментов использовали среды и режимы культивирования, приведенные в материалах и методах.

Препараты подвергали частичной очистке пере-осаждением, высаливанием, хроматографическими и абсорбционными методами.

Используя стандартные процедуры, исследовали физико-химические свойства выделенных белков, их молекулярную массу.

Результаты описаний ЦГТаз 4-х видов бактерий, выделенных в нашей лаборатории и охарактеризованных филогенетическими методами, сведены в таблице.

Суммируя полученные результаты, можно указать на тот факт, что описания ЦГТаз P.macerans IB-1053 и P.campinasensis IB-417, P.illinoisensis IB-1087 были близки к описанным ранее для культур тех же видов.

Весьма важной характеристикой ЦГТаз является их специфичность в отношении спектра ЦД, накапливающихся в продуктах конверсии крахмала [1]. По преобладающему продукту реакции дают название ЦГТазе, указывая что она, например, относится к β -типу. По доминантному продукту реакции принято разделять циклизующие ферменты на a -[11], β -[8] и γ -ЦГТазы [12; 13].

Вместе с тем, в расчет не берется тот факт, что само соотношение [ a -ЦД]:[ β -ЦД]:[ γ -ЦД] в продуктах реакции динамично меняется во времени, и зачастую, весьма существенно. Например для a -ЦГТаз P.macerans описаны серьезные вариации соотношения a -ЦД: β -ЦД: γ -ЦД, возникающие в течение реакции, равно как и при вариациях стартового соотношения субстрат/фермент (E/S).

Учитывая, что условия выбора режима реакции зависит, как от воли автора исследования, так и от использованных им методов измерения циклизующей активности, сравнение ЦГТаз, кинетические свойства которых были исследованы в разных лабораториях зачастую не возможно.

В этой связи для изучения кинетических особенностей ЦГТаз, имевшихся в нашем распоряжении, был применен собственный подход, основанный на определении безразмерных коэффициентов, являющихся отношениями молярных концентраций KU α =[ β -ЦД]/[ a -ЦД] и KU γ =[ β -ЦД]/[ γ -ЦД] в продуктах суточной конверсии крахмала.

Измерения велись в широком диапазоне стартового соотношения (E/S), а в качестве единицы характеризующей количество ЦГТазы, была использована ее активность в мкКат, измеренная фенолфталеиновым методом.

На рис. представлены результаты сравнения каталитических свойств четырех штаммов циклодекстриногенных бактерий относящихся к роду Paeni-bacillus .

Таблица. Сравнение свойств ЦГТаз четырех видов бактерий рода Paenibacillus

	Источник ЦГТазы	S*	ММ**	pH о пт	рН стаб.	т „ опт.	τ τ 50% ***	pI	16S рРНК NCBI
А	P.illinoisensis IB-1087	β -	68	7,0	5-9	55	19 мин	5.1	FN422001.1
Б	P.macerans IB-1053	a -	70	5,5	7-9,5	55	6,2 мин	4.9	AM406669.1
В	P.ehimensis IB-739	β -	75	6,0	5,5-8,2	40	5,3 мин	Н.д	FN582329.1
Г	P.campinasensis IB-417	β -	82	7,0	6-10	60	3 часа 15 мин	Н.д	FN429977.1

Прим.: S* – специфичность (дозировка 10 ед/г крахмала, 40^оС, 1 ч); ММ** – молекулярная масса; τ _50% *** – время экспозиции образца ЦГТазы при 55⁰С, вызывающее 50% снижение его активности при рН 6,0 без субстрата

Рис. Зависимость выхода циклодекстринов от концентрации ЦГТаз, выделенных из бактерий различных видов в течение 24 ч трансформации 2,75% крахмала: А – Paenibacillus campinasensis IB-417; Б – Р.ehimensis IB-739; В – P.macerans IB-I4; Г – P.illinoisensis IB-1087. Кривые (1) и (2) обозначают величины безразмерных коэффициентов равных молярным отношениям [ β -ЦД]/[ a -ЦД] и [ β -ЦД]/ [ γ -ЦД] в продуктах реакции соответственно

Обнаружено, что во всех 4-х случаях зависимость молярных соотношений KUα=[β-ЦД]/[a-ЦД] и KUγ=[β-ЦД]/[γ-ЦД] от величины (E/S) в двойных логарифмических координатах вырождаются в линейные (рис.1). Полученная информация позволяет подробно описывать и сравнивать динамику накопления различных форм ЦД, а также ее зависимость от дозы внесенного фермента для разных типов ЦГТаз. Например, при использовании β-ЦГТазы алкалотолерантной P.campinasensis (А), накопление β-ЦД относительно a-ЦД падает с увеличением относительной дозировки фермента и этот процесс сопровождается ростом отношения KUα, из чего следует, что удельный выход γ-ЦД также снижается по мере продолжения реакции. Схожими кинетическими особенностями обладает бета-ЦГТаза P.illinoisensis (Г). Оба фермента, на ранних стадиях реакции (что адекватно низким удельным дозировкам ЦГТаз) катализируют преимущественное образование длинноцепочечных β-ЦД и γ-ЦД, которые по мере накопления начинают изомеризоваться в a-ЦД (6 глюкозных остатков). ЦГТаза P.macerans (В) катализирует трансформацию крахмала иным образом: сначала в среде накапливается a-ЦД, который по мере увеличения (E/S) трансформируется в β-ЦД. Каталитическая «ретрансформация» a- и γ-ЦД в β- форму, по мере нарастания их концентраций в ходе реакции явля- ется типичной и хорошо известной особенностью ферментов данного типа [15]. Бактерии вида P.ehimensis секретируют ЦГТазу широкой специфичности (Б), инициирующую превращение крахмала до смесей, пригодных для одновременного синтеза одновременно трех циклических декстринов. Для этого фермента характерно образование относительно постоянных соотношений a-, β- и γ-ЦД, мало зависящих от дозы внесенной ЦГТазы. ЦГТаза P.campinasensis в первые моменты реакции отличается ярко выраженной β-специфичностью, (А) но по мере трансформации субстрата в среде накапливается значительное количество a-формы. Оптимальными для трансформации крахмала в ЦД для всех четырех типов ЦГТаз можно считать их удельные дозировки на уровне 8÷10 мкКат/1г субстрата.

Таким образом, 4 культуры бактерий, секретирующие ЦГТазу и выделенные 3-мя различными методами, с использованием бета-ЦД и КМЦ-Na в качестве субстрата накопительных сред, принадлежат к роду Paenibacillus. ЦГТазы P.illinoisensis IB-1087; P.macerans IB-1053; P.campinasensis IB-417 по своим физико-химическим свойствам близки к описанным в литературе. Описание ЦГТазы P.ehimensis IB-739 (ВКМ B-2680D) выполнено впервые. Также впервые обнаружено, что при действии ЦГТаз на крахмал зависимость отношений [ β -ЦД]/[ a -ЦД] и [ β -ЦД]/[ γ -ЦД] от величины (E/S) в двойных логарифмических координатах вырождаются в линейную.

Николай Глебович Усанов, один из авторов, скоропостижно скончался при подготовке статьи к публикации.