Сравнительная анатомо-морфологическая характеристика клеток эпидермиса и паренхимы коры гипокотиля у двух генотипов томата (Solanum lycopersicum L.) в условиях хлоридного засоления in vitro

Засоление относится к одним из главных стрессовых факторов, лимитирующих выращивание большинства сельскохозяйственных культур во многих агроклиматических зонах, значительно снижая качество продукции и урожайность (1). Согласно сведениям ФАО, площадь засоленных почв в мире, включая щелочное засоление, достигает 950 млн га. По раз- личным опубликованным данным, в мире от 33 до 50 % общей площади орошаемых земель подвержено засолению (2, 3). Томат (Solanum lycopersi-cum L.) высокочувствителен к засолению. Пороговое значение электропроводности почвенного раствора (ЕСе) для этой культуры составляет 2,5 дСм/м (4), что по классификации ФАО соответствует почве со слабой степенью засоления (ЕСе = 2,0-4,0 дСм/м).

Необходимое требование при изучении механизмов устойчивости растений к стрессовым абиотическим воздействиям, в частности к засолению, заключается в создании и поддержании контролируемых константных условий, что достаточно сложно достичь при тестировании в вегетационных сосудах в защищенном грунте или же вовсе невозможно при проведении полевых испытаний. Как известно, изменяющиеся факторы окружающей среды (температура, относительная влажность воздуха, интенсивность освещения, степень загрязненности воздуха и др.) кардинальным образом влияют на реакцию растений на засоление, что может привести как к ее усилению, так и к компенсации видимых проявлений (5, 6). Культивирование растений, а также их изолированных фрагментов, органов и тканей на питательных средах с добавлением токсичных ионов позволяет за сравнительно непродолжительный период провести скрининг потенциально устойчивых форм уже на ранних этапах развития, которые у многих культур, в том числе у томата, наиболее критические (2, 6). Немаловажно и то, что в ряде экспериментов установлена прямая корреляция между устойчивостью к засолению на стадии каллусной ткани in vitro и взрослых растений in vivo. Подобная тенденция отмечена у культурного и диких видов томата (7, 8), а также у растений семейства Cucurbtaceae (дыни, арбуза, огурца) (9).

В условиях засоления in vitro наблюдается ингибирование роста проростков и регенерантов томата по различным морфометрическим показателям, а также заметное снижение содержания хлорофилла в листьях (6, 8). Высокие концентрации хлорида или сульфата натрия приводят к изменению процессов дыхания, водного обмена и минерального питания (10-12). Это обусловлено гиперосмотическим и токсическим влиянием избыточных ионов (13, 14).

В последние десятилетия большое внимание исследователей уделено картированию локусов количественных признаков устойчивости томата к абиотическим стрессовым факторам, имеющим полигенную природу. Этот молекулярно-генетический подход находит применение в практической селекции при проведении маркер-опосредованного отбора растений томата с повышенной устойчивостью к засолению (15, 16). Существенный прогресс в понимании механизмов солеустойчивости достигнут за счет введения гетерологичных генов в растительный геном методами генетической инженерии. С использованием различных генно-инженерных стратегий к настоящему времени получены многочисленные сведения о трансгенных растениях томата, обладающих повышенной устойчивостью к засолению как in vitro, так и в условиях гидропоники и защищенного грунта (2, 5, 17). В то же время сведения о действии токсических ионов на мезострук-турную организацию тканей различных органов томата крайне ограничены (18-20). Новые знания в этой области в дополнение к молекулярно-генетическим и физиолого-биохимическим исследованиям будут способствовать большему пониманию адаптивных реакций растений на стрессовые условия, раскрытию механизмов устойчивости к засолению, разработке диагностических тестов и, в конечном итоге, повышению эффективности селекции на указанный признак.

Мы впервые на экспериментальной модели (два генотипа культурного томата с неодинаковой устойчивостью к засолению) сравнили анатомо-морфологические характеристики клеток эпидермиса и паренхимы коры гипокотиля в условиях in vitro при воздействии различных концентраций ионов Na + и Cl ^- .

Цель настоящего исследования — изучение мезоструктурной организации клеток эпидермиса и паренхимы коры гипокотиля у томата в условиях засоления NaCl.

Методика. Растительным материалом служили асептические проростки томата (Solanum lycopersicum L.) различающихся по солеустойчивости форм — более чувствительной селекционной линии ЯЛФ, используемой в качестве отцовской формы при получении гибрида F 1 Юниор, и более устойчивого сорта Рекордсмен. Донорные проростки получали из семян, которые подвергали поверхностной стерилизации в течение 10 с в 96 % этаноле, а затем в течение 7-8 мин в 20 % водном растворе хлорсодержащего коммерческого отбеливателя АСЕ с добавлением нескольких капель детергента Tween 20 («Merck», Германия). Обработанные семена 3-4 раза промывали дистиллированной водой и помещали в сосуды с питательной средой, основу которой составляют минеральные компоненты и витамины в соответствии с прописью Мурасиге-Скуга (MS) (21), с добавлением 3 % сахарозы и 0,7 % агара. У проростков на этапе образования 1-го настоящего листа отсекали корневую часть в районе гипокотиля таким образом, чтобы длина фрагментов составляла 1,5-2,0 см, после чего их переносили на среду для индукции ризогенеза ( 1 /₂ дозы макро- и микросолей по прописи MS, 2 % сахарозы, 0,7 % агара, 0,2 мг/л 3-индолилмасляной кислоты) без NaCl (контроль) или с добавлением NaCl (опыт) в концентрациях 50, 100, 150, 200 и 250 мМ. Растения культивировали в контролируемых условиях световой комнаты при температуре 23 ° С, освещенности 3,0 клк и фотопериоде 16/8 ч (день/ночь).

На 8-е сут культивирования из срединной части проростков вырезали фрагменты гипокотилей размером 2-3 мм, фиксировали в 2,5 % растворе глутарового альдегида («Merck», Германия) на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) с добавлением 1,5 % сахарозы. Постфиксацию образцов в 1 % растворе OsO4 («Sigma», США), обезвоживание в этаноле повышающейся концентрации (30, 50, 70, 96 и 100 %), окиси пропилена («Fluka», Германия), и заключение в смесь эпоксидных смол EponTM 812 и Araldite («Merck», Германия) выполняли по стандартной методике (22). Полутон-кие срезы толщиной 1-2 мкм получали с помощью ультрамикротома LKB-V («LKB», Швеция) и монтировали на предметные стекла. Препараты просматривали и фотографировали, используя микроскоп Olympus BX51 («Olympus», Япония), оборудованный камерой Color View II («Soft Imaging System», Германия). Среднюю площадь клеток эпидермиса и паренхимы коры гипокотиля на срезе, а также площадь межклеточного пространства на срезе определяли с помощью программного обеспечения Cell-A («Olympus», Япония). Для каждого варианта проанализировали не менее 500 клеток каждого типа ткани (20-30 полутонких срезов), полученных от сегментов гипокотилей трех независимых проростков.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрических критериев Стьюдента, Фишера и Дункана. Расчеты осуществляли с помощью статистической программы AGROS (версия 2.11) и стандартных пакетов компьютерной программы Microsoft Excel 2007.

Результаты. Первичный ответ клеток на избыточное содержание ионов натрия и хлора заключается в регуляции водного и осмотического 320

гомеостаза за счет модификаций многих физиологических функций. Эта регуляция обеспечивается взаимодействием процессов, протекающих в цитоплазме клетки и ее оболочке, приводя тем самым к изменению размера и формы клеток в тканях (13, 23).

По результатам гистологического исследования мы выявили существенные различия между исследуемыми генотипами томата с неодинаковой солеустойчивостью по размеру и форме эпидермальных клеток гипокотиля у проростков, выращенных в контрольных условиях (без засоления). Так, средняя площадь клеток эпидермиса у линии ЯЛФ была в 1,3 раза больше, чем у сорта Рекордсмен (соответственно 843,5 и 644,5 мкм2) (рис. 1, А). Кроме того, эпидермальные клетки гипокотиля у линии ЯЛФ характеризовались более округлой формой (рис. 2, А). Анатомо-морфологические различия между генотипами были установлены и в отношении паренхимных клеток коры гипокотиля: у линии ЯЛФ они имели округлую форму (см. рис. 2, А), тогда как у сорта Рекордсмен — неправильную (см. рис. 2, Ж). При этом, как и в случае эпидермальных клеток, средняя площадь паренхимных клеток коры гипокотиля у линии ЯЛФ была значительно больше, чем у сорта Рекордсмен (см. рис. 1, Б).

Рис. 1. Средняя площадь клеток эпидермиса (А) и паренхимы коры (Б) гипокотиля у проростков томата (Solanum lycopersicum L.) при культивировании in vitro на среде Мурасиге-Скуга с разным содержанием NaCl: 1 — линия ЯЛФ (менее солеустойчива), 2 — сорт Рекордсмен (более солеустойчив). Различия между вариантами, отмеченными одинаковыми буквами, статистически недостоверны по критерию Дункана ( а = 0,05).

Были установлены различия в реакции клеток гипокотиля по размеру и форме в зависимости от степени засоления, типа растительной ткани, а также генотипических особенностей (см. рис. 1, 2). Так, при культивировании проростков томата линии ЯЛФ на среде с добавлением наименьшей изученной концентрации NaCl (50 мМ) площадь эпидермальных клеток гипокотиля оказалась существенно меньше по сравнению с контролем (среда без засоления). Последующее повышение концентрации NaCl в среде до 200 мМ не приводило к изменению их размера, тогда как в условиях максимального хлоридного засоления наблюдалось значительное увеличение площади клеток, которая превышала соответствующие показатели не только в других вариантах опыта, но и в контроле. Кроме того, в условиях 250 мМ NaCl округлые клетки эпидермиса приобретали угловатые контуры (см. рис. 2, Е).

В отличие от линии ЯЛФ, достоверное снижение площади эпидермальных клеток гипокотиля у сорта Рекордсмен происходило при большей концентрации NaCl в среде (100 мМ). При 200 и 250 мМ NaCl наблюдалось увеличение площади клеток в этой ткани, и полученные значения были сравнимы с таковыми в контроле. Что касается формы, то в условиях умеренного и сильного засоления (концентрация NaCl 100 мМ и выше) эпидермальные клетки гипокотиля у томата сорта Рекордсмен приобретали более характерную для указанного типа ткани овально-продолговатую конфигурацию (см. рис. 2, И-М).

Рис. 2. Поперечные срезы срединной части гипокотиля у проростков томата (Solanum ly-copersicum L.) линии ЯЛФ (А-Е, менее солеустойчива) и сорта Рекордсмен (Ж-М, более солеустойчив) при культивировании in vitro на среде Мурасиге-Скуга с разным содержанием NaCl: А, Ж - без засоления; Б, 3 - 50 мМ NaCl; В, И - 100 мМ NaCl; Г, К - 150 мМ NaCl; Д, Л — 200 мМ NaCl; Е, М — 250 мМ NaCl. Звездочками отмечены паренхимные клетки коры гипокотиля, у которых наблюдается плазмолиз.

Клетки паренхимы коры гипокотиля, как и эпидермальные, оказались чувствительны к присутствию в среде NaCl, причем их реакция различалась между генотипами и зависела от степени засоления (см. рис. 1, Б). Так, добавление в состав питательной среды NaCl в концен-322

трациях 50 и 100 мМ приводило к существенному уменьшению площади паренхимных клеток в коре гипокотиля у проростков томата линии ЯЛФ. При больших концентрациях стрессора наблюдалось изменение их формы, выражающееся в сильном уплощении (см. рис. 2, Г-Е). В присутствии 250 мМ NaCl отмечалось значительное увеличение средней площади паренхимных клеток коры гипокотиля у линии ЯЛФ (более чем в 1,2 раза относительно контроля и в 2,0-2,5 раза — относительно других вариантов опыта).

В отличие от линии ЯЛФ, у томата сорта Рекордсмен 50 и 100 мМ NaCl засоление не приводило к уменьшению площади паренхимных клеток гипокотиля по сравнению с контролем. Напротив, наблюдалось их увеличение (площадь клеток при 50 и 100 мМ NaCl составила соответственно 4158 и 4412 мкм2), однако статистически значимых различий как между этими вариантами, так и с контролем установлено не было. Существенное уменьшение площади паренхимных клеток наблюдалось в том случае, когда проростки томата сорта Рекордсмен культивировали на среде с добавлением 150 мМ NaCl. Следует отметить, что присутствие в среде токсичных ионов в высоких концентрациях приводило к изменению конфигурации паренхимных клеток гипокотиля у указанного сорта. Как и в случае клеток эпидермиса, они приобретали более характерную для этого типа ткани округлую форму (см. рис. 2, К-М).

Уменьшение площади клеток эпидермиса (у обоих генотипов) и паренхимных клеток коры гипокотиля томата (у линии ЯЛФ) в сочетании с изменением их формы в условиях умеренного хлоридного засоления можно рассматривать в нескольких аспектах. С одной стороны, это может быть положительной адаптивной реакцией клеток на стрессовые условия. Известно, что нарушение водного баланса растений при действии NaCl, выражающееся в снижении оводненности тканей, приводит к уменьшению размера клеток и, тем самым, понижает осмотический потенциал клеточного сока (24, 25). С другой стороны, не исключено, что уменьшение клеток в размере происходит вследствие ингибирования их роста растяжением за счет дезорганизации цитоскелета. Так, С. Wang с соавт. (26) показали, что при 12-часовом воздействии 150 мМ и 250 мМ NaCl наблюдалось увеличение количества полимерного актина и увеличение диаметра пучков филаментов в эпидермальных клетках корня, гипокотиля и семядольного листа у проростков Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Через 18 ч в присутствии 150 мМ NaCl организация актинового цитоскелета в этих клетках сохранялась, однако добавление 250 мМ NaCl приводило к распаду актиновых филаментов, а впоследствии — к гибели проростков.

Резкое увеличение площади клеток эпидермиса и паренхимы гипокотиля при культивировании проростков томата линии ЯЛФ на среде, содержащей 250 мМ NaCl, может быть связано с их гибелью. В пользу такого предположения свидетельствует то обстоятельство, что в указанных условиях у проростков происходил некроз участка гипокотиля, который находился в непосредственном контакте с питательной средой. Регенерацию корней у таких проростков не наблюдали. Кроме того (см. рис. 2, Е), мы отчетливо отмечали большое число паренхимных клеток с характерными признаками необратимого плазмолиза, что, по-видимому, приводило к их гибели и последующему набуханию мертвых клеток. Однако подобное предположение требует дополнительных доказательств с помощью электронной микроскопии и гистохимических методов.

Присутствие в среде токсичных ионов Na+ и Cl- вызывало измене- ние размеров межклетников в паренхиме коры гипокотиля, причем в зависимости от генотипа реакция была кардинально противоположной (табл.).

Площадь межклетников (мкм²) в паренхиме коры гипокотиля у изученных генотипов томата (Solanum lycopersicum L.) in vitro на среде Мурасиге-Скуга под влиянием разных концентраций NaCl

Концентрация NaCl, мМ	Линия ЯЛФ (менее солеустойчива)	Сорт Рекордсмен (более солеустойчив)
0	108,8 8	92,1def 8
50	82,1bcde	128,2h
100	66,8ab	103,4f 8
150	77,4abcd	94,9def 8
200	87,7cdef	67,2ab
250	100,3ef 8	61,5ab

Примечание. Различия между вариантами, отмеченными одинаковыми буквами, статистически недостоверны по критерию Дункана (а = 0,05).

Так, при действии 50 мМ NaCl у сорта Рекордсмен отмечали существенное увеличение межклеточного пространства по сравнению с контролем. Схожую реакцию, выражающуюся в увеличении объема межклетников в палисадном мезофилле настоящего листа, наблюдали ранее у проростков томата сортов Mariela и Cambell 28, выращенных в условиях почвенного засоления (75 и 150 мМ NaCl) (19). Повышение концентрации NaCl приводило к уменьшению площади межклетников у сорта Рекордсмен: при засолении 100 и 150 мМ она была сравнима с контролем, тогда как при больших концентрациях NaCl эта величина оказалась соответственно в 1,4 и 1,5 раза меньше.

В отличие от сорта Рекордсмен, размер межклетников паренхимных клеток коры гипокотиля у проростков томата линии ЯЛФ, культивируемых на среде с добавлением NaCl в концентрациях от 50 до 200 мМ, был значительно меньше по сравнению с контролем. Максимальная изученная концентрация стрессового агента приводила к увеличению площади межклетников, величина которой была сравнима с таковой в контрольном варианте.

Таким образом, представленные экспериментальные данные согласуются с полученными ранее результатами, когда было показано, что реакция клеток разных тканей на хлоридное засоление не только сильно варьирует на межвидовом уровне, но и зависит от особенностей конкретных анализируемых генотипов одного вида.

Итак, по результатам гистологического исследования установлены существенные различия между исследуемыми генотипами томата по размеру, а также форме эпидермальных и паренхимных клеток коры гипокотиля. Воздействие токсичных ионов Na + и Cl ^- оказывало значительное влияние на эти цитоморфологические параметры у обоих генотипов. Различия между генотипами отмечены и в отношении реакции межклетников в паренхиме коры гипокотиля в условиях засоления. Установлено, что чувствительность эпидермальных и паренхимных клеток гипокотиля к присутствию в среде NaCl у томата сорта Рекордсмен ниже, чем у линии ЯЛФ. Изменение размера и формы клеток указанных типов тканей при засолении NaCl in vitro может использоваться в качестве цитологических маркеров для сравнительной оценки генотипов томата по чувствительности и(или) устойчивости к солевому стрессу. При этом для получения наиболее объективных и достоверных результатов сравнительную оценку необходимо осуществлять в широком диапазоне концентраций стрессового агента по комплексу анатомо-морфологических показателей (размер и форма клеток).