Сравнительная характеристика кариометрических параметров микроспороцитов и клеток тапетума сформированных пыльников длинно- и короткостолбчатых растений Jasminum fruticans L. (Oleaceae)

Гетеростилия покрытосеменных растений – это генетически контролируемый полиморфизм цветков, который связан с системой несовместимости. Явление гетеростилии, или разностолбчатости цветков, отмечено у представителей 36 семейств покрытосеменных растений [Агаджанян, 2000; Ganders 1979]. В зависимости от особенностей строения андроцея и гинецея цветка в пределах вида выделяют, как правило, две флоральные, или морфологические, формы. Цветки различных морфологических форм дифференцируются по высоте столбика пестика, форме рыльца пестика, размерам тычинок, пыльников, пыльцевых зерен [Pailler, Thompson, 1997; Tompson, Dommée, 2000; Klein, Freitas, Da Cunha, 2009; Valois-Cuesta, Soriano, Ornelas, 2011; Keller, de Vos, Conti, 2012]. Ключевым вопросом в изучении гетеростилии является выявление функционального значения полиморфизма цветков. Наиболее распространенным объяснением его биологической роли является свойственная гетеростильным видам гетероморфная несовместимость, при которой эффективным оказывается переопыление цветков, относящихся к различным морфологическим типам, т.е. когда пыльца из короткостолбчатых цветков попадает на рыльца длинностолбчатых цветков или наоборот. Как правило, у гетеростильных видов более эффективным является опыление, которое происходит между морфами, а опыление цветков внутри одной морфлогиче-ской формы показывает слабую завязываемость семян [Stevens, Murray, 1982; Valois-Cuesta, Soriano, Ornelas, 2011; Wu et al., 2015; Gao et al., 2021]. H.G. Baker было высказано предположение, что гетеростиль-ные виды можно рассматривать как переходную форму от гермафродитных видов к однополым растениям [Baker, 1960; Жинкина, 2000]. В частности, у Mussaenda pubescens (Rubiaceae) отмечены случаи редукции пыльников у длинностолбчатых цветков, и семязачатков – у короткостолбчатых [Li et al., 2010]. Проведенные ранее исследования генезиса пыльников и семязачатков дистильного вида Jasminum fruti-cans L. (Oleaceae) не выявили различий в ходе генезиса пыльников и семязачатков, а также редукции генеративных элементов коротко- и длинностолбчатых растений [Кузьмина, 2018, 2000; Шевченко, Плугатарь, 2019]. Однако флоральные формы J. fruticans различаются по долям морфологически нормальных пыльцевых зерен [Кузьмина, 2017]. Различия по фертильности пыльцевых зерен длинно- и короткостолбчатых растений указаны и для других гетеростильных видов ( Limonium caspium (Willd.) Gams., L. gmelinii (Willd.) O. Kuntzw, Goniolimon elatum (Fisch. ex Spreng.) Boiss . (Plumbaginaceae) [Демьянова, 2014], что может свидетельствовать о различной функциональной активности генеративных элементов флоральных форм гетеростильных видов.

Известно, что стенка гнезда (микроспорангия) сформированного пыльника состоит из нескольких слоев клеток, представленных эпидермисом, эндотецием, средним слоем и тапетумом, окружающих клетки спорогенной ткани [Батыгина, Васильева, 2002]. Наиболее функционально важными тканями микроспорангия являются спорогенная ткань и тапетум. Развитие спорогенной ткани приводит к формированию микроспороцитов – материнских клеток пыльцевых зерен. Tапетум как внутренний слой стенки микроспорангия, клетки которого непосредственно прилегают к спорогенной ткани, рассматривается как наиболее активная и чувствительная к стрессовым воздействиям соматическая ткань пыльника, которая в этот период функционирует как проводящая, обеспечивающая поступление питательных веществ к микроспороцитам [Резникова, 1984; Gothandam, Kim, Chung, 2007; Yeung et al., 2011]. Известно, что нарушения микроспорогенеза и формирования гаметофита сопряжены с морфоструктурными изменениями клеток тапетума, в которых изменения затрагивают главным образом эндоплазматический ретикулум [Vi- jayaraghavan, Ratnaparkhi, 1979; Gothandam, Kim, Chung, 2007; Shi et al., 2010; Du et al., 2019].

Для определения интенсивности функционирования клеточных структур служат ядерные и ядрышковые характеристики клеток, поскольку они отражают интенсивность белкового метаболизма клетки, а следовательно, дают представление о функциональной активности генома клетки [Челидзе, Зацепина, 1988; Архип-чук, 1995]. Определение числа ядрышек и их размеров позволяет дать оценку активности генов рибосомной РНК (рРНК) на цитологическом уровне [Архипчук, 1995], что служит основой для биотестирования и определения цитогенетической стабильности видов при воздействии различных внешних факторов [Дуброва, 1989; Архипчук, 1995; Владимирова, Муратова, 2005; Калаев и др., 2009]. Кариометрические исследования репродуктивных структур высших растений [Резникова, Бугара, 1979; Романова, Третьякова, 2005; Трочин-ская, Бланковская, Тоцкий, 2010] не затрагивают вопросы гетеростилии видов.

Цель работы – сравнительная кариометрическая характеристика микроспороцитов и тапетальных клеток у сформированных пыльников длинно- и короткостолбчатых растений J. fruticans в связи с определением уровня их функционального состояния у растений различных флоральных (морфологических) форм.

Материалы и методы исследования

Jasminum fruticans L. (жасмин кустарниковый) – дистильный вид флоры стран Средиземноморья, Западной Европы, Малой Азии, Черноморского побережья Кавказа, а также Южного берега Крыма [Голубев, 1996]. Для исследования пыльников длинно- и коротостолбчатых растений J. fruticans брали терминальные бутоны длиной 1.5–2 мм. Сбор материала проводили на территории Никитского ботанического сада (г. Ялта, Республика Крым; 44°30ʹ34ʺс.ш. 34°13ʹ58ʺ в.д.) в 2019–2021 гг. Для приготовления постоянных препаратов бутоны фиксировали в смеси F. A. A. (formalin : acetic acid : alcohol 70%). Материал обезвоживали с помощью изопропилового спирта, после чего делали постоянные препараты бутонов. Препараты окрашивали гематоксилином и алциановым синим, учитывая, что гематоксилин обеспечивает визуализацию базофильных структур, к которым относятся ядра и РНК-содержащие структуры [Коржев-ский, 2007], а алциановый синий дает интенсивную окраску клеточных стенок, что позволяет четко идентифицировать границы клеток. Анализ препаратов проводили с помощью микроскопа AxioScope A.1 (Carl Zeiss, Germany) и цифровой камеры AxioCamERc5s (Carl Zeiss, Germany). Для каждой флораль-ной формы на поперечных срезах пыльников делали измерения клеток 30 пыльников. Кариометрические показатели получены с помощью программы AxioVision Rel. 4.8.2. (Carl Zeiss, Германия). Основными параметрами измерений были площадь клетки, площадь ядра и площадь ядрышка. В случае многоядерных и многоядрышковых структур определяли их суммарную площадь. Кроме того, подсчитывали количество ядер и ядрышек, приходящихся на клетку. Ядерно-ядрышковое отношение (ЯЯО) определяли как отношение площади ядра к площади ядрышка, в случае многоядерных и многоядрышковых клеток вычисления проводили, используя суммарные показатели.

Вычисления и статистическую обработку данных делали в программном приложении Statistica 10.0 (StatSoft. Ins., USA). Определение статистически значимых различий проводили на основании t-критерия Стьюдента и критерия Фишера (F-критерий) при уровне статистической значимости p < 0.05. Сравнение выборочных долей клеток по числу ядер осуществляли с помощью критерия χ² Пирсона [Гашев, Бетляе-ва, Лупинос, 2018]. Кариометрические данные представлены в виде: Х ± S x , где X – среднее арифметическое, S x – стандартная ошибка среднего.

Результаты исследования

Развитие стенки микроспорангия J. fruticans идет в центробежном направлении, при котором деление клеток первичного париетального слоя приводит к формированию тапетума и вторичного париетального слоя. Деление последнего в свою очередь дает начало эндотецию и среднему слою. Таким образом, у J. fruticans тапетум является производным первичного париетального слоя, который в сформированном микроспорангии многослойный, секреторного типа (рис. 1). Установлено, что в тапетуме сформированных пыльников J. fruticans преобладают двуядерные клетки. Так, в тапетуме длинностолбчатых растений 73.7% клеток двуядерные, а у короткостолбчатых растений их доля составляет 69.7%, что не представляет статистически значимого различия (χ² = 3.94; df = 1; p = 0.05).

Известно, что для многоядрышковых клеток наиболее информативным показателем оценки функциональной активности генетического аппарата считается число ядрышек в клетке [Архипчук, 1995]. Количество ядрышек в тапетальных клетках варьирует от 1 до 14, при этом преобладают двуядрышковые клетки, что объясняется наличием двух ядер в большинстве клеток данной ткани. Так, у длинностолбчатых растений количество таких клеток составляет 48.3%, а у короткостолбчатых – 46.4% (рис. 2). Однако встречаются и клетки, ядра которых содержат большее число ядрышек. Показано, что у короткостолбчатых растений доля клеток, содержащих 6–8 ядрышек, выше, чем у длинностолбчатых растений. Клетки, содержащие более 9 ядрышек, встречаются у обеих флоральных форм лишь в единичных случаях.

Рис. 1. Поперечные срезы микроспорангиев длинно- ( 1 ) и короткостолбчатых ( 2 ) растений J. fruticans : msc – микроспороциты; t – тапетум

[Cross section of microsporangium of long-styled ( 1 ) and short-styled ( 2 ) of J. fruticans : msc – microsporocytes; t – tapetum]

Рис. 2. Суммарное число ядрышек в клетках тапетума сформированных пыльников длинно- ( 1 ) и короткостолбчатых ( 2 ) растений J. fruticans .

Ось X – число ядрышек в ядре; Ось Y – процент клеток от общего числа проанализированных клеток

[The total number of nucleolus in tapetum cells of the formed anthers of long-styled ( 1 ) and short-styled ( 2) plants J. fruticans.

X axis – number of nucleoli in cell’s nuclear; Y axis – percentage of cells from the total number of cells analyzed]

Данные кариометрического анализа тапетальных клеток представлены в табл. 1. Клетки тапетума короткостолбчатых растений содержат более крупные ядра, суммарная площадь их ядрышек также оказывается больше по сравнению с длинностолбчатыми растениями. При этом, несмотря на статистически значимое различие клеток тапетума флоральных форм по площадям ядер и ядрышек, значения ЯЯО у них выражено слабо. Хотя можно отметить, что в сформированных пыльниках длинностолбчатых растений клетки тапетума по ЯЯО незначительно превышают аналогичный показатель короткостолбчатых. Анализ кариометрических параметров клеток тапетума сформированных пыльников длинно- и короткостолбчатых растений J. fruticans показал, что у обеих флоральных форм преобладают двуядерные клетки. В каждом ядре, как правило, содержится по одному ядрышку, а суммарное количество ядрышек на клетку равно двум. Таким образом, преобладают двуядрышковые тапетальные клетки. У короткостолбчатых растений, как упоминалось выше, чаще отмечаются клетки, содержащие более 5 ядрышек, что отражается на увеличении суммарной площади ядрышек, кроме того, они имеют более крупные ядра. Однако, в целом, это не оказывает статистически значимого влияния на показатели функциональной активности тапетальных клеток сравниваемых флоральных форм.

Таблица 1

Кариометрические параметры клеток тапетума сформированных пыльников длинностолбчатых и короткостолбчатых растений J. fruticans

[Karyometric parameters of tapetum cells of formed anthers of long-styled and short-styled plants J. fruticans ]

Параметр	Длинно-cтолбчатые (n=1000)	Короткостолбчатые (n=1000)	t-критерий	р-уровень
Суммарная площадь ядер, мкм2	83.25±1.13	90.16±1.34	-3.95	0.001**
Суммарная площадь ядрышек в клетке, мкм2	8.36±0.14	9.01±0.12	-3.46	0.001**
Ядерно-ядрышковое отношение (ЯЯО)	10.98±0.14	10.67±0.14	1.54	0.12ns

Примечание. n – количество проанализированных клеток; ns – отсутствует статистически значимое различие при уровне статистической значимости p < 0.05; ** – различие статистически значимо при p < 0.05.

Микроспороциты у J. fruticans в гнезде пыльника расположены двумя–четырьмя рядами (см. рис. 1). Это крупные клетки, площадь которых варьирует в зависимости от морфотипа растения. Площадь поперечного сечения микроспороцитов в пыльниках у длинностолбчатых растений составляет 351.52±4.20 мкм², а у короткостолбчатых – 330.27±3.92 мкм². Микроспороциты J. fruticans содержат одно крупное ядро, занимающее центральное положение, в котором четко выражено одно ядрышко. Лишь в редких случаях отмечается образование двух–трех ядрышек. Для клеток с небольшим количеством ядрышек информативной характеристикой их функциональной активности является размер одиночных ядрышек [Архипчук, 1995]. Однако этот показатель относителен, поскольку размеры клеток и ядер у флоральных форм также различны (табл. 2).

Таблица 2

Кариометрические параметры микроспороцитов длинностолбчатых и короткостолбчатых растений J. fruticans

[Karyometric parameters of tapetum cells of formed anthers of long-styled and short-styled plants J. fruticans ]

Показатель	Длинно-cтолбчатые (n=600)	Короткостолбчатые (n=600)	t-критерий	р-уровень
Площадь ядра, мкм2	134.50± 2.12	112.26± 1.53	8.52	0.001**
Площадь ядрышка в клетке, мкм2	8.36± 0.11	7.72± 0.09	4.41	0.001**
Ядерно-ядрышковое отношение (ЯЯО)	17.61± 0.36	15.59± 0.27	4.52	0.001**

Примечание. ** – различие статистически значимо при p < 0.05.

Поэтому наиболее объективную картину функциональной активности клетки демонстрирует ядерно-ядрышковое отношение (ЯЯО), свидетельствующее об интенсивности белкового метаболизма клетки [Машкин, Назарова, 1976; Хроленко и др., 2011]. У микроспороцитов короткостолбчатых растений ЯЯО меньше (15.59± 0.27) по сравнению с длинностолбчатыми растениями (17.61± 0.36).

Обсуждение результатов

Известно, что с увеличением размеров ядрышка в ядре снижается значение ЯЯО, что характерно для клеток, у которых наблюдается усиление активности белоксинтезирующей системы клетки. Следовательно, можно говорить, что у флоральных форм J. fruticans материнские клетки микроспор являются функционально неоднородными: бо́льшую интенсивность белкового метаболизма проявляют микроспоры пыльников короткостолбчатой формы. Как правило, увеличение активности ядрышковых организаторов хромосом, сопровождающееся снижением показателей ЯЯО, наблюдается при стрессовых повреждающих факторах (низких и высоких температурах. засухи. засоления. антропогенных воздействий и др.), что приводит к синтезу «стрессовых белков», являющихся ответной на цитологическом уровне адаптивной реакцией на стресс [Дуброва, 1989; Калаев и др., 2005; Вострикова, 2010; Калашник, 2013]. Таким образом, ядерно-ядрышковое отношение служит кариологическим признаком адаптивной устойчивости клеток. Как отмечалось выше, у дистильного вида J. fruticans микроспороциты короткостолбчатой формы имеют меньшее значение ЯЯО, что позволяет рассматривать их как более стабильную клеточную структуру по сравнению с аналогичными клетками длинностолбчатой формы. Характерно, что у длинностолбчатой формы дистильного вида Mussaenda pubescens (Rubiaceae) наблюдали процессы дегенерации пыльников [Li et al., 2010], что служит признаком функционального разделения полов в зависимости от морфологического типа растений. Процессы дегенерации генеративных элементов отмечены и у растений, отнесенных к группе потенциально обоеполых. Как правило, у этих растений в женских цветках деструктивные процессы в микроспорангиях проявляются в мейотический и постмейотический периоды, при этом на ранних этапах развитие и формирование клеточных слоев стенки микроспорангия, в том числе и тапетальной ткани, проходит без аномалий [Кордюм, Глущенко, 1976; Nugent et al., 2019]. В этом плане соотношение ядрышковой активности микроспороцитов и клеток тапетума пыльников длинно- и короткостолбчатых растений у J. fruticans может свидетельствовать о сходстве тенденции процессам развития пыльников, которые наблюдаются в пестичных и тычиночных цветках диэцичных растений с рудиментами органов другого пола. В частности, как пример переходной формы от гетеростилии к диэции, рассматривается Morinda parvifolia Bartl. ex DC. (Rubiaceae), у которого, несмотря на продуцирование морфологически одинаковых пыльцевых зерен растениями обеими флоральными формами, жизнеспособность пыльцы короткостолбчатых растений (S-форма) выше, чем у длинностолбчатых растений (L-форма) [Liu et al., 2012].

Заключение

В тапетуме сформированных пыльников у обеих флоральных форм J. fruticans преобладают двуядерные клетки, суммарное число ядрышек в которых равно двум. У короткостолбчатых растений по сравнению с длинностолбчатыми выше число клеток, в которых находится 6–8 ядрышек, что отражается на показателях суммарной площади ядрышек. Однако значение функциональной активности клеток тапетума длинно- и короткостолбчатых растений, оцениваемой как значения ядерно-ядрышкового отношения, не имеют статистически значимых различий.

Микроспороциты J. fruticans различаются по цитометрическим параметрам в зависимости от фло-ральной формы растения. Площади клеток и ядерных структур больше у длинностолбчатых растений.

Кариометрический анализ микроспороцитов показал статистически значимое снижение ядерно-ядрышкового отношения у короткостолбчатых растений по сравнению с длинностолбчатыми, что характеризует усиление функционирования их белоксинтезирующей системы. Данный факт можно рассматривать как проявление дифференциации функционирования мужской генеративной системы вида в зависимости от флорального (морфологического) типа растения