Сравнительная эффективность разных молекулярно-генетических методов в диагностике туберкулеза

¹ Введение. Туберкулез (ТБ) в настоящее время остается одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний как в России, так и в мире. Он является острейшей проблемой здравоохранения, имеющей значительные экономические и социальные последствия [1–3]. В современной фтизиатрии большая роль отводится этиологической диагностике ТБ, что означает выявление возбудителя ТБ и определение его характеристик (спектра лекарственной чувствительности, видовой принадлежности) [3–6]. Эти данные очень важны для установления диагноза, своевременного начала химиотерапии, выбора правильного режима лечения и осуществления контроля за проводимой терапией, а также выполнения профилактических мероприятий в очагах туберкулезной инфекции [4, 6]. Золотым стандартом микробиологической диагностики ТБ по-прежнему остаются традиционные методы посева на твердые и жидкие питательные среды [6, 7]. Однако метод посева биологического материала на твердые питательные среды отличается долговременностью получения результатов (2–3 мес.) и максимально позволяет обнаружить микобактерии только в 60% случаев. В последние годы произошли значительные изменения в методической базе клинических лабораторных исследований для выявления и характеристики возбудителя ТБ [8]. Разработаны новые молекулярно-генетические методы (МГМ) этиологической диагностики ТБ и определения лекарственной чувствительности возбудителя, которые существенно повысили ее эффективность и уменьшили время получения результатов [4, 9–11]. МГМ в настоящее время приобретают особую значимость в связи с повсеместным (в России и мире) распространением ТБ со множественной лекарственной устойчивостью возбудителя [1] и являются незаменимыми для быстрого определения лекарственной устойчивости (ЛУ) и выбора оптимального режима химиотерапии. В России разработаны и разрешены к применению различные виды МГМ (полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (PCR Real Time), ДНК-стриповая технология, метод биологических микрочипов, картриджная технология Xpert® MTB/Rif и др.), отличающиеся разной информативностью, чувствительностью и специфичностью анализа. Нам представляется целесообразным изучить в сравнительном аспекте эффективность применения разных молекулярно-генетических методов в практике фтизиатрии.

Цель — провести сравнительный анализ эффективности использования разных МГМ, а именно PCR Real Time, биологических микрочипов и метода Xpert® MTB/RIF в диагностике ТБ и определении лекарственной чувствительности к рифампицину (Rif) за многолетний период наблюдения.

Материал и методы . Дизайн исследования — открытое нерандомизированное, диагностическое. Проведен ретроспективный анализ результатов исследования мокроты, выполненный разными МГМ (PCR Real Time, биологические микрочипы, Xpert® MTB/RIF) 1992 больных впервые выявленным ТБ легких, находившихся на стационарном лечении в Саратовском областном клиническом противотуберкулезном диспансере в 2014–2018 гг. Результаты исследований получены путем выкипировки данных

методом случайной выборки из медицинской документации (истории болезни стационарного больного (форма №003/у), медицинская карта амбулаторного больного ТБ (форма №081/у)). В зависимости от использованного МГМ больные распределены на три группы, которые были сопоставимы по клиническим формам ТБ, распространенности процесса и бактериовыделению. Группу 1 составили 134 пациента, у которых для подтверждения диагноза ТБ выполнялось исследование мокроты методом PCR Real Time. PCR Real Time — это современная и высокотехнологическая методика, в которой детекция продуктов ПЦР происходит непосредственно во время амплификации [10]. Исследования выполнялись с использование ДНК-амплификатора с оптическим блоком для проведения ПЦР в режиме реального времени (iCycler iQ, «Био-Рад лаборатории», США) и набора реагентов фирмы «ДНК-технологии», Россия. В группу 2 включены 1417 пациентов, у которых в комплексной диагностике ТБ применялся метод Xpert® MTB/RIF Xpert® MTB/RIF — это автоматизированная система ПЦР-диагностики картриджного типа для обнаружения ДНК M. tuberculosis complex и быстрого определения ЛУ к рифампицину (Rif) с полностью интегрированной обработкой образцов. Исследования проводились с применением прибора GeneXpert® и одноразовых картриджей («Cepheid», США). Группу 3 составил 441 пациент, у которых для подтверждения диагноза ТБ и определения ЛУ использовался метод биологических микрочипов (биочип). Метод микрочипов включает двухэтапную мультиплексную ПЦР участков генов, гибридизацию и регистрацию продуктов реакции на биочипе, позволяет выявлять ДНК M. tuberculosis complex и определять ЛУ микобактерий к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам. Исследования проводились с применением аппаратно-программного комплекса «Чип-детектор-01» и тест-системы «TB-Биочип», ООО «Биочип-ИМБ», Россия. Во всех трех группах оценивалась в сравнительном аспекте диагностическая чувствительность методов PCR Real Time, Xpert® MTB/RIF и метода биологических микрочипов в зависимости от клинической формы туберкулезного процесса и наличия или отсутствия у пациентов бактериовыделения. Дополнительно у 294 больных, выделенных из общего числа обследованных, проводилось изучение эффективности определения лекарственной чувствительности микобактерий к рифампицину (Rif). Изучалась диагностическая чувствительность (ДЧ), специфичность (ДС) и эффективность (ДЭ) метода Xpert® MTB/RIF (150 больных) и метода биологических микрочипов (144 человека) по сравнению с методом абсолютных концентраций при посеве на твердые питательные среды.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием компьютерных программ Microsoft® Excel для Windows XP® и Statistica 6.0. Для оценки диагностической эффективности методов использовали формулу Байеса на основе таблиц взаимной сопряженности «четырехпольной таблицы». Для сравнения значимости различий в двух группах использовали χ2-тест. При определении значимости различий относительных величин принимался критический уровень значимости, равный 0,05.

Результаты. При сравнении результатов исследований методов PCR Real Time, Xpert MTB/Rif и биологических микрочипов наибольшее число ДНК M. tuberculosis было обнаружено в группе 1 у 99

Сравнительная результативность разных молекулярно-генетических методов этиологической диагностики туберкулеза

Таблица 1

Больные туберкулезом легких	ДНК M. tuberculosis обнаружена/общее число обследованных, абс. (%)			p
	PCR Real Time группа 1	Xpert MTB/Rif группа 2	Биочип группа 3
МБТ (+)	56/64 (87,5)	258/566 (45,6)	203/256 (79,3)	p <0,001 p 1-2=0,103 p 12--33<0,001
МБТ (–)	43/70 (61,4)	226/851 (26,6)	107/185 (57,8)	p <0,001 p 1-2=0,563 p 12--33<0,001
Всего	99/134 (73,9)	484/1417 (34,2)	310/441 (70,3)	p <0,001 p 1-2=0,504 p 1-3<0,001

П р и м еч а н и е : МБТ (+) — пациенты, у которых в мокроте были обнаружены микобактерии ТБ любым микробиологическим методом. МБТ (–) — пациенты, в мокроте которых не было обнаружено микобактерий ТБ ни одним из микробиологических методов.

Таблица 2

Сравнительная эффективность использования разных молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза в зависимости от клинической формы туберкулеза

Клинические формы туберкулеза легких ДНК M. tuberculosis обнаружена/общее число обследованных, абс. (%) p PCR Real Timе группа 1 Xpert MTB/Rif группа 2 Биочип группа 3 Инфильтративный 32/50 (64) 311/890 (35) 223/323 (69,1) p <0,001 p1-2=0,479 p12--33<0,001 Диссеминированный 36/40 (90) 83/173 (48) 35/47 (74,5) p <0,001 p1-2=0,074 p21-3-3=0,0012 Туберкулемы 19/27 (70,4) 20/99 (20) 23/31 (74,2) p <0,001 p1-2=0,799 p12--33<0,001 Другие (очаговый, кавернозный и фиброзно-кавернозный, плеврит, цирротический туберкулез) 12/17 (70,6) 70/255 (27,5) 29/40 (72,5) p <0,001 p1-2=0,878 p12--33<0,001 Всего 99/134 (73,9) 484/1417 (34,2) 310/441 (70,3) p <0,001 p1-2=0,372 p1-3<0,001 из 134 пациентов с ТБ легких. ДЧ метода PCR Real Time составила 73,9%, что было достоверно больше по сравнению с методом Xpert MTB/Rif (группа 2) — 484 положительных результата из 1417 обследованных соответственно, ДЧ — 34,2%, p 1-2<0,0001.

В группе 3 (метод биочип) обнаружено 310 положительных результатов у 441 больного ТБ легких, ДЧ метода составила — 70,3%, что соответствовало уровню чувствительности PCR Real Time — 73,9%. Данные представлены в табл. 1.

Как следует из табл. 1, ДЧ методов зависела от массивности бактериальной популяции у пациентов. Доминирующее число положительных результатов всеми методами было получено у больных с бактериовыделением (МБТ (+)): группа 1-87,5%, группа 2-45,6%, группа 3-79,3%. Наиболее высокой чувствительностью как у пациентов с бактериовыделением, так и у небациллярных пациентов (МБТ (–)) обладали методы PCR Real Time — 87,5 и 61,4%, соответственно, и метод биологических микрочипов — 79,3 и 57,8%, что было достоверно больше по сопоставлению с методом Xpert MTB/Rif 45,6 и 26,6% (табл. 1).

Дополнительно нами проведено сравнительное изучение эффективности использования этих мето- дов в зависимости от клинической формы ТБ легких (табл. 2).

В группе 1 самая высокая ДЧ метода наблюдалась у больных диссеминированным ТБ легких — 90%, и при разных клинических формах она колебалась от 64 до 71%. В группе 2 самая высокая ДЧ также регистрировалась у больных диссеминированным ТБ легких, но в целом была значительно ниже по сравнению с группой 1, интервал колебаний при всех формах туберкулеза составлял 27,5-48%. В третьей группе существенных различий в ДЧ метода в зависимости от клинической формы туберкулеза не установлено, интервал колебаний — 69,1-74,5%. В целом при всех клинических формах туберкулеза ДЧ методов в группах 1 и 3 была достоверно выше, чем в группе 2 (табл. 2).

В дальнейшем мы провели изучение эффективности определения ЛУ МБТ к Rif методом Xpert® MTB/RIF (150 больных) и методом биологических микрочипов (144 человека) по сопоставлению с методом абсолютных концентраций при посеве на твердые питательные среды. Данные представлены в табл. 3 и 4.

Таблица 3

Сравнительные результаты определения лекарственной устойчивости к рифампицину (Rif) методом Xpert MTB/Rif и методом абсолютных концентрации при посеве на твердые питательные среды

Наименование метода исследования				Чувствительность Xpert MTB/Rif (%)	Специфичность Xpert MTB/Rif (%)
посев на твердые питательные среды	n	Xpert MTB/Rif
		устойчивые к Rif (абс.)	чувствительные к Rif (абс.)
Устойчивые к Rif (абс.)	58	52	6
Чувствительные к Rif (абс.)	92	10	82	89,7	89,1
Всего	150	62	88

Таблица 4

Сравнительные результаты определения лекарственной устойчивости к рифампицину (Rif) методом биологических микрочипов и методом абсолютных концентрации при посеве на твердые питательные среды

Наименование метода исследования				Чувствительность метода биологических микрочипов (%)	Специфичность метода биологических микрочипов (%)
посев на твердые питательные среды	n	метод биологических микрочипов
		устойчивые к Rif (абс.)	чувствительные к Rif (абс.)
Устойчивые к Rif (абс.)	66	62	4
Чувствительные к Rif (абс.)	78	22	56	93,9	71,8
Всего	144	84	60

ЛУ МБТ к Rif в исследуемой выборке ( n =150) методом Xpert MTB/Rif была обнаружена у 52 больных туберкулезом (34,7%), а методом посева на твердые питательные среды у 58 пациентов этой же группы, то есть ДЧ метода Xpert MTB/Rif по определению ЛУ к Rif составила 89,7%. Под ДЧ в аспекте определения ЛУ МБТ мы понимаем процент верно идентифицированных ЛУ штаммов МБТ, а под ДС — процент верно идентифицированных лекарственно-чувствительных штаммов МБТ, где эталоном являются культуральные методы исследования (посев на твердые питательные среды). При посеве на твердые питательные среды рост культуры МБТ чувствительный к Rif был получен в 92 (61,3%) случаях, в то же время у этих же пациентов МБТ, чувствительные к Rif, методом Xpert MTB/Rif были обнаружены у 82 человек (54,7%), совпадение результатов по чувствительности к Rif была определена только у 82 человек, и в 10 случаях результаты исследования не совпали, таким образом, ДС метода Xpert MTB/Rif составила 89,1 %, а Дэ метода Xpert MTB/Rif — 89,4%.

Результаты сравнительного анализа определения ЛУ МБТ к Rif методом биологических микрочипов и посева на твердые питательные среды представлены в табл. 4. Из 144 обследованных пациентов ЛУ к Rif методом биологических микрочипов была обнаружена у 62 человек (43,1%) а методом посева — у 66 (45,8%), то есть ДЧ метода биочипов составила 93,9%. Лекарственная чувствительность МБТ к Rif методом посева обнаружена у 78 больных (54,2%), а методом биочипов — у 56 (38,9%), таким образом, у 22 больных методом биочип-технологий были обнаружены мутации в гене гене Rpo B , кодирующие ЛУ к Rif, но не подтвержденные культуральными исследованиями, ДС метода биочипов составила 71,8%, а ДЭ — 82,9%.

Обсуждение. В настоящее время в микробиологической диагностике ТБ наступает молекулярно- генетический период, который имеет серьезные перспективы для решения проблем ускоренного выявления МБТ и определения ЛУ [4]. На рынке продукции имеется большое количество разных видов молекулярно-генетических методов, тест-систем, обладающих неодинаковыми операционными характеристиками, имеющими свои преимущества и недостатки. Врачи практического здравоохранения испытывают значительные трудности при выборе правильного метода исследования и трактовке полученных результатов. Проведенные нами исследования позволили выявить особенности разных молекулярно-генетических исследований и определить более целенаправленные показания по их применению. Так, полученные нами данные о наиболее высокой чувствительности метода PCR Real Timе в подтверждении диагноза туберкулеза — 73,9% — аналогичны результатам наших более ранних исследований [12], в которых ДЧ этого метода составляла 77,4%. Одним из высокочувствительных методов также является метод биологических микрочипов: по нашим данным, метод не уступает PCR Real Timе, и ДЧ его сопоставима и составляет 70,3%. Метод Xpert MTB/Rif обладает недостаточной чувствительностью при обследовании больных с целью этиологической диагностики ТБ, его ДЧ, по нашим подсчетам, — 34,2%, поэтому мы считаем, что Xpert MTB/Rif может использоваться только как скрининговый тест с последующим применением (в случае отрицательного результата при соответствующей ТБ клинической картине) более информативных молекулярно-генетических методов. Однако следует отметить, что при низкой ДЧ для подтверждения диагноза туберкулеза Xpert MTB/Rif при определении ЛУ МБТ к Rif не уступает методу биологических микрочипов, и его ДЧ составляет 89,7%, у метода биологических микрочипов — 93%. ДС при определении ЛУ к Rif у метода Xpert MTB/Rif — 89,1%, у метода биочи- пов — 71,8%. Оба метода отличаются от культуральных исследований более высоким процентом обнаружения ЛУ к Rif, не подтвержденной методом посева на твердых питательных средах. На наш взгляд, это является закономерным и объяснимым, поскольку молекулярно-генетические методы направлены на выявление мутаций в гене Rpo B МБТ, кодирующих ЛУ к Rif. Появление генетических мутаций является фактором, предшествующим формированию ЛУ, выявляемой посевом на твердых средах, и у данных пациентов в дальнейшем следует ожидать нарастание числа генных мутаций, которое в ближайшее время приведет к формированию ЛУ к Rif. Мы полагаем, что этим объясняется и более низкая специфичность метода биологических микрочипов — 71,8 против 89,1 % у метода Xpert MTB/Rif, так как метод биочипов выявляет 29 типов мутаций в гене Rpo B [4], в то время как метод Xpert MTB/Rif — только пять наиболее часто встречающихся видов мутаций этого гена.

Выводы:

• 1.    При сравнительном анализе методов PCR Real Time, Xpert MTB/Rif и биологических микрочипов установлено, что метод PCR Real Time и метод биологических микрочипов выявляют ДНК МБТ у больных ТБ достоверно чаще (73,9 и 70,3% соответственно) по сравнению с методом Xpert MTB/Rif (34,2%).

• 2.    Более высокая чувствительность методов PCR Real Time и биологических микрочипов по сравнению с методом Xpert MTB/Rif наблюдается не только при обследовании пациентов с бактериовыделением (87,5 и 79,3 против 45,6%, соответственно), но и у олигобациллярных пациентов (61,4 и 57,8 против 26,6% соответственно), у которых подтверждение диагноза ТБ традиционными микробиологическими методами оказывается невозможным.

• 3.    Диагностическая чувствительность МГМ зависит от клинической формы ТБ и колеблется от 64 до 90% у метода PCR Real Time, от 20 до 48% — у метода Xpert MTB/Rif и от 69,1 до 74,5% — у метода биологических микрочипов.

• 4.    При более низкой диагностической чувствительности метода Xpert MTB/Rif в этиологической верификации диагноза ТБ при определении ЛУ к Rif метод Xpert MTB/Rif обладает достаточно высокими операционными характеристиками (ДЧ — 89,7%, ДС — 89,1%, ДЭ — 89,4%), сравнимыми с методом биочипов (ДЧ — 93,9%, ДС — 71,8%, ДЭ — 82,9%).