Сравнительная морфологическая оценка глиальных изменений при сосудистой деменции и болезни Альцгеймера

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ / RESEARCH ARTICLES (3).964

(3).964

Морфологическим субстратом развития деменции является ряд патологических процессов, включая как нейродегенеративные, так и сосудистые проявления. Все виды деменции имеют схожие молекулярные механизмы, ответственные за этиологию и прогрессирование заболевания [1]. Наиболее распространенным нейродегенератив-ным заболеванием, вызывающим деменцию, признана болезнь Альцгеймера (БА, G30 по МКБ-10), основными патогенетическими морфологическими проявлениями которой являются амилоидные (сенильные) бляшки и нейрофибрил- лярные клубки [1–2]. Также при БА наблюдаются выраженные нейродегенеративные процессы: атрофия и истончение медиальной височной и теменной коры, гибель и сморщивание нейронов в гиппокампе, пролиферация и активация глиальных клеток [3].

Существует гетерогенная группа расстройств головного мозга, при которых когнитивные нарушения обусловлены патологией сосудистого происхождения. Эти расстройства, объединенные под термином «сосудистая деменция» (FO1 по МКБ-10). Для сосудистой деменции (СД) характерны ишемические изменения, связанные с нарушением кровоснабжения головного мозга.

Морфологически они чаще выявляются в виде лакун или микроинфарктов, локализующихся в коре или подкорковых структурах. Согласно литературным данным, сосудистые факторы риска, такие как гипертония, атеросклероз и цереброваскулярные заболевания, связаны с возникновением деменции и снижением когнитивных функций у человека [4]. Несмотря на то, что деменция, развивающаяся при БА, представляет значительный научный интерес, ее патогенез очень сложен и недостаточно изучен. Большая часть исследований до сих пор была сфокусирована на нейронах. Однако, становится общепри-знана роль глиальных клеток в патологии многих нейродегенеративных заболеваний, что может представлять их потенциальную значимость в качестве терапевтической мишени.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: сравнительный анализ нейронов, глиальных клеток, их качественный и количественный состав в неокортексе пациентов, страдавших болезнью Альцгеймера и сосудистой деменцией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены пациенты, страдавшие сосудистой деменцией (n = 8) и болезнью Альцгеймера (n = 5). Группы пациентов не отличались по полу (р > 0,05) и возрасту (p > 0,05). Во время аутопсии были извлечены фрагменты лобной доли правого полушария головного мозга пациентов для последующего изготовления гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, и для выполнения иммуногистохимического исследования. Для идентификации клеток микроглии использовали первичное кроличье моноклональное антитело к Iba-1 (ионизированный кальций-связывающий белок-1, клон AIF1, P55008, FineTest, Китай, в рабочем разведении 1:850), для визуализации астроцитов – первичное мышиное моноклональное антитело к GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок, P14136, FineTest, Китай, в рабочем разведении 1:20000). Инкубацию с первичными антителами проводили во влажной камере при

4 °С в течение ночи. Проведение иммуногистохимического исследования осуществлялось с использованием в качестве системы визуализации Mouse/Rabbit UnoVue HRP/DAB Detection system (UMR1000PD, Diagnostic BioSystems, США), инкубация со вторичным антителом длительностью 30 минут выполнена при температуре 37 °С. После визуализации иммуногистохимической реакции с помощью раствора диаминобензидина до коричневого цвета анализируемых структур клеточные ядра докрашивали гематоксилином Майера.

Оцифровка гистологических срезов коры лобной доли правого полушария головного мозга пациентов выполнена на сканирующем микроскопе Leica Aperio AT2 при увеличении объектива ×40,0. С использованием компьютерной программы анализа изображений ImageJ (США) и ее приложения «Multi-point» проводили подсчет клеточной плотности нейронов и общей глии (без разделения на клеточный состав) для расчета нейроглиального индекса, который оценивался как отношение общего числа клеток глии к числу нейронов. Также проведен анализ тинкто-риальных свойств нейронов с выделением группы нормохромных, гипохромных, гиперх-ромных нейронов, клеток-теней и сморщенных нейронов для анализа частоты дистрофически измененных клеток. В компьютерной программе анализа изображений ImageJ проводили подсчет количества астроцитов и клеток микроглии с расчетом их клеточной плотности в 20-ти непе-рекрывающихся полях зрения, также выполняли измерения площади клеточных тел астроцитов и толщины глиальной пиальной пластинки [5]. Была оценена доля различных морфологических типов клеток микроглии (неактивная, промежуточная и активированная или амебоидная микроглия) в анализируемых участках головного мозга, согласно принципам классификации мор-фотипов клеток микроглии на основе данных литературы [6–7]. Для всех измерений площадь поля зрения составила 14361,527 мкм2. Количественная оценка позитивности иммуногистохи- мической реакция с антителами к GFAP проведена в компьютерной программе анализа изображений Aperio ImageScope (v 9.0.1.1506, США). Позитивность анализировали по стандартному алгоритму подсчета позитивных пикселей̆ «Positive Pixel Count v9».

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета статистических программ Statistica 12.0. Данные описательной статистики представлены как в виде медианы (Me) и квартилей (Q25%; Q75%), так и в относительных значениях переменных. С целью проверки статистической нулевой гипотезы об однородности групп исследования использовали непараметрический U-критерий теста Манна-Уитни. Для всех статистических тестов значение p < 0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В группе пациентов, страдавших сосудистой деменцией (n = 8), медиана клеточной плотности нейронов коры лобной доли правого полушария головного мозга составила 187,6 (163,2; 224,3) клеток/мм2, при этом доля нормохромных нейронов была 29,6%, нейронов с неспецифическими изменениями структуры – 70,4%. Изменения в нейронах проявлялись в виде нарушения тинкториальных свойств в сторону усиления (ги-перхромные нейроны) и уменьшения (гипохромные нейроны) интенсивности окрашивания ядра. Выявлены нейроны с признаками дистрофических изменений (клетки-тени и гиперхромные сморщенные нейроны). При морфометрическом анализе в неокортексе головного мозга пациентов, страдавших СД, среди группы нейронов с неспецифическими изменениями преобладала популяция гиперхромных нейронов, клеточная плотность которых составила 57,1 (28,6; 114,2) клеток/мм2. Плотность гипохромных нейронов была 16,3 (8,2; 24,5), клеток-теней – 40,8 (32,6; 57,1) клеток/мм2.

Клеточная плотность общей глии в неокор-тексе лобной доли правого полушария головного мозга пациентов, страдавших СД, составила 501,7 (407,9; 587,4) клеток/мм², нейроглиальный 10

индекс был равен 2,6. Плотность Iba-1 позитивной микроглии была 90,7 (74,2; 107,2) клеток/мм2, в морфологическом профиле которой преобладали клетки с промежуточным морфотипом – 65,8%. Неактивный вариант клеток микроглии составил 26,5%, активированный морфотип – 7,7%. Клетки микроглии были диффузно рассеянны по всей площади коры лобной доли правого полушария головного мозга пациентов с более плотным расположением в области II–IV слоев неокортекса. Очаговые увеличения клеточной плотности микроглии выявлены в периваскулярных зонах или в очагах атрофических изменений головного мозга (данные участки не включены в анализ). GFAP-позитивные астроциты определялись во всех клеточных слоях неокортекса и характеризовались диффузным расположением клеток с более выраженной экспрессией маркера в I–IV слоях неокортекса. Плотность астроцитов коры лобной доли правого полушария головного мозга пациентов, страдавших сосудистой деменцией, составила 238,7 (179,0;343,2) клеток/мм2, общая позитивность экспрессии маркера глиального фибриллярного кислого белка составила 95,0 (92,0; 97,0)%. При морфологическом исследовании GFAP-позитивные астроциты преимущественно имели типичную кустистую морфологию с экспрессией белка GFAP в телах и отростках клеток. От тела астроцитов радиально отходили хорошо визуализируемые 10–12 широкие первичные отростки с многочисленными тонко ветвящимися вторичными отростками, с частичным перекрытием между отростками соседних астроцитов. Среди «кустистых» форм определялись астроциты с измененной морфологией, обусловленной частичной деградацией отростков, при этом первичные отростки были короткими либо без четких контуров и направления, тонко ветвящиеся отростки не визуализировались. Общая площадь астроцитов в неокортексе головного мозга пациентов данной группы исследования составила 78,4 (60,8; 98,0) мкм2.

В группе пациентов, страдавших болезнью Альцгеймера (n = 5), клеточная плотность нейро- нов в неокортексе была 136,0 (98,9; 189,6) кле-ток/мм2, при этом доля нормохромных нейронов равна 7,5%, нейронов с неспецифическими изменениями структуры – 92,5% со значимым преобладанием популяции гиперхромных нейронов, клеточная плотность которых была 82,4 (57,7; 115,4) клеток/мм2; плотность гипохромных нейронов – 20,6 (8,2; 49,5), клеток-теней – 8,2 (0,0;8,2) клеток/мм2. Клеточная плотность общей глии в неокортексе лобной доли правого полушария пациентов с БА составила 568,9 (482,3;651,3) клеток/мм2, нейроглиальный индекс – 4,2. Плотность Iba-1позитивной микроглии была 123,7 (107,2; 156,7) клеток/мм2, в морфологическом профиле преобладали клетки с промежуточным морфотипом 81,2%, мелкая разветвленная микроглия составила 9,2%, активированный мор-фотип – 9,6%.

Общая клеточная плотность GFAP-позитивных астроцитов в данной группе исследования составила 179,0 (149,2; 268,6) клеток/мм2. При морфологическом исследовании GFAP-позитивные астроциты имели типичную кустистую морфологию с выраженной экспрессией белка GFAP и ее преимущественной локализацией в телах клеток. От тела радиально отходили первичные тонкие отростки с короткими разветвлениями. Вторичные тонко ветвящиеся отростки соседних клеток контактировали друг с другом со слабовы-раженным перекрытием и/или без перекрытия. Среди астроцитов с «кустистой» морфологией выявлены астроциты с признаками класмато-дендрозиса (англ. clasmatodendrosis), характеризующиеся фрагментацией и истончением/исчез-новением дистальных тонких отростков [8]. Площадь сомы GFAP-позитивных астроцитов составила 62,5 (50,8; 75,1) мкм2. Позитивность экспрессии маркера GFAP в данной группе исследования была 93,0 (89,0; 94,0) %. При проведении сравнительного статистического анализа установлены различия в морфологическом составе и морфометрических параметрах нейронов и глиальных клеток групп исследования (табл. 1).

Так у пациентов, страдавших БА, отмечено достоверное уменьшение клеточной плотности нейронов в неокортексе лобной доли правого полушария головного мозга более чем на 27,5% со значимым преобладанием доли измененных нейронов по сравнению с пациентами, страдавшими сосудистой деменцией.

Таблица 1. Сравнительная характеристика нейронов и глиального компонента неокортекса пациентов с сосудистой деменцией и болезнью Альцгеймера

Table 1. Comparative characteristics of neurons and glial components of the neocortex of patients with vascular dementia and Alzheimer's disease

Морфологический признак	Группа исследования		Критерий
	пациенты с СД	пациенты с БА	значимости, p

Характеристика нейронов

Плотность нейронов, клеток/мм2	187,6 (163,2; 224,3)	136,0 (98,9; 189,6)	< 0,0001
Доля нормальных нейронов, %	29,6	7,5	< 0,0001
Доля нейронов с неспецифическими изменениями, %	70,4	92,5	< 0,0001

Характеристика глиальных клеток

Плотность общей глии, клеток/мм2	501,7 (407,9; 587,4)	568,9 (482,3; 651,3)	0,04
Нги	2,6	4,2	< 0,0001

Характеристика Iba1-позитивной микроглии

Плотность клеток микроглии, клеток/мм2	90,7 (74,2; 107,2)	123,7 (107,2; 156,7)	< 0,0001
Доля неактивного морфотипа, %	26,5	9,2	< 0,0001
Доля промежуточного морфотипа, %	65,8	81,2	< 0,0001
Доля активированного морфотипа, %	7,7	9,6	0,2

Характеристика GFAP-позитивной астроглии

Общая клеточная плотность астроцитов, клеток/мм2	238,7 (179,0; 343,2)	179,0 (149,2; 268,6)	0,0070
Общая площадь сомы астроцитов, мкм2	78,4 (60,8; 98,0)	62,5 (50,8; 75,1)	< 0,0001
Позитивность GFAP, %	95	93	0,009

Наряду с нейродегенеративными процессами в неокортексе пациентов с БА отмечено увеличение клеточной плотности общего числа глии на 13,4% по сравнению с пациентами с СД, что нашло отражение в увеличении показателя нейроглиального индекса более чем в 1,5 раза (4,2 против 2,6 соответственно; табл. 1).

Среди глиального компонента для пациентов с БА характерно более выраженная микроглиальная реакция вещества головного мозга: клеточная плотность микроглии была на 36,4% выше с достоверным преобладанием промежуточных форм (на 23,4%) и снижением доли покоящегося морфотипа клеток микроглии (на 65,0%). Следовательно, мик-роглиальная реакция вещества головного мозга пациентов, страдавших болезнью Альцгеймера, является доминирующей в патогенезе данного заболевания по сравнению с сосудистой деменцией.

Астроцитарная реакция глии неокортекса лобной доли правого полушария головного мозга была достоверно выше у пациентов с СД (таблицы 1–2, рис. 1–2), которая характеризовалась нарастанием общей клеточной плотности (на 33,4%), увеличением площади сомы астроцитов (на 25,4%) и более выраженной экспрессии маркера GFAP (на 2,2%) по сравнению с пациентами, страдавшими БА [9]. Наряду с различиями по общей клеточной плотности астроцитов в группах исследования выявлены достоверные отличия морфометрических параметров интерламинарных и протоплазматических астроцитов (таблица 2 рис. 1–2). Интерламинарные астроциты молекулярного слоя неокортекса головного мозга пациентов, страдавших сосудистой деменцией, достоверно отличались более высокой клеточной плотностью (выше на 17,5%) и большей площадью сомы (на 31,7%, рис. 1).

Согласно литературным данным, в зависимости от стадии заболевания, при болезни Альцгеймера может наблюдаться уменьшение плотности интерламинарных астроцитов вплоть до их полной потери [10]. Увеличение плотности коротких отростков интерламинарных астроцитов в неокортексе пациентов с СД отражалось в утолщении глиальной пиальной пластинки на 20,5% (14,1 (10,7;19,0) мкм против 11,7 (8,9;15,0) мкм у пациентов с БА; р = 0,0002; рис. 1).

Протоплазматические астроциты III и V кортикального слоя лобной доли правого полушария головного мозга пациентов с СД также отличались увеличением клеточной плотности (на 29,9%), гипертрофией сомы (на 25,6%) и формированием хорошо визуализирующихся толстых радиальных (первичных) отростков с выраженными ветвлениями, с частичным перекрытием между вторичными отростками соседних астро цитов от аналогичных клеток вещества головного мозга пациентов с БА (рис. 2).

Таблица 2. Сравнительная характеристика интерламинарных и протоплазматических астроцитов неокортекса пациентов с сосудистой деменцией и болезнью Альцгеймера

Table 2. Comparative characteristics of interlaminar and protoplasmic astrocytes of the neocortex of patients with vascular dementia and Alzheimer's disease

Морфологический признак	Группа исследования		Критерий значимости, p
	пациенты с СД Me (Q25; Q75)	пациенты с БА Me (Q25; Q75)
Клеточная плотность интерламинарных астроцитов, клеток/мм2	350,6 (313,3; 417,8)	298,4 (238,7; 343,2)	0,0001
Площадь сомы интерламинарных астроцитов, мкм2	85,9 (66,7; 104,7)	65,2 (52,6; 80,3)	< 0,0001
Клеточная плотность протоплазматических астроцитов III слоя неокортекса, клеток/мм2	193,9 (149,2; 223,8)	149,2 (134,3; 149,2)	< 0,0001
Площадь сомы протоплазматических астроцитов III слоя неокортекса, мкм2	73,0 (56,4; 94,8)	58,1 (48,0; 71,6)	0,0023
Клеточная плотность протоплазматических астроцитов V слоя неокортекса, клеток/мм2	164,1 (134,3; 208,9)	149,2 (119,4; 179,0)	0,0002
Площадь сомы протоплазматических астроцитов V слоя неокортекса, мкм2	66,9 (51,3; 85,3)	64,8 (52,3; 73,8)	0,0424

Рис. 1. Микрофото. Глиальная пиальная пластинка (стрелка) и плотность интерламинарных астроцитов в группах исследования: a – сосудистая деменция; b – болезнь Альцгеймера; иммуногистохимия с DAB, маркер GFAP, увеличение ×100 Fig. 1. Photomicrograph. Glial pial plate (arrow) and interlaminar astrocyte density in the study groups: a – vascular dementia; b – Alzheimer's disease; immunohistochemistry with DAB, GFAP marker, magnification ×100

Рис. 2 . Микрофото. Протоплазматические астроциты III слоя неокортекса лобной доли правого полушария в группах исследования: a – сосудистая деменция; b – болезнь Альцгеймера. Астроциты с признаками класматодендрозиса (стрелка); иммуногистохимия с DAB, маркер GFAP, увеличение ×400

Fig. 2. Photomicrograph. Protoplasmic astrocytes of layer III of the neocortex of the frontal lobe of the right hemisphere in the study groups: a – vascular dementia; b – Alzheimer's disease. Astrocytes with signs of clastic dendrites (arrow); immunohistochemistry with DAB, GFAP marker, magnification ×400

Таким образом, гиперплазия астроцитов коры лобной доли правого полушария головного мозга пациентов с СД, гипертрофия их сомы и коротких отростков с высокой экспрессией маркера GFAP являлась не только проявлением реактивных изменений на фоне сосудистой патологии головного мозга данных пациентов, но и в сочетании с высоким процентом дистрофически измененных нейронов и высоким соотношением промежуточного морфотипа клеток микроглии указывала на нейротоксический эффект данных клеток глии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Патогенетические механизмы нейродегенера-тивного процесса при болезни Альцгеймера реализуются посредством активации микроглии и снижением протекторной активности астроцитов. Астроцитарная реакция неокортекса головного мозга пациентов с сосудистой деменцией наряду в нейро-протекторным действием характеризуется нейротоксическим эффектом, что отражается в последующей активации микроглии и сопровождается изменением тинкториальных свойств нейронов.