Сравнительная нейропротекторная эффективность фармакологических агентов при ударно-контузионной травме головного мозга у крыс

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) представляет собой одну из наиболее значимых медико-социальных проблем современного здравоохранения, являясь ведущей причиной повышения уровня смертности и развития стойкой инвалидизации среди населения молодого и трудоспо- собного возраста [1]. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно более чем у 50 млн человек диагностируется ЧМТ, причем у подавляющего большинства пациентов вследствие перенесенной патологии развиваются долгосрочные когнитивные, двигательные и психоэмоциональные нарушения, требующие длитель- ной реабилитации с использованием фармакотерапии1. Эпидемиологические исследования также подчеркивают значительную корреляцию между ЧМТ и риском развития нейродегенеративных заболеваний в отдаленном периоде [2].

Несмотря на положительную динамику в разработке принципов хирургической и интенсивной терапии, специфическая фармакологическая коррекция, направленная на устранение последствий, вызванных вторичным повреждением головного мозга, так и остается ключевой задачей, а большинство используемых нейропротектор-ных средств демонстрировали относительную эффективность в контролируемых исследованиях [3].

В основе патогенеза ЧМТ лежат универсальные патофизиологические механизмы вторичного повреждения, развивающиеся в течение часов или дней после первичной механической травмы [4]. Ключевыми звеньями данного каскада являются глутаматная эксайтотоксичность, оксидативный стресс, митохондриальная дисфункция, нейровоспаление, а также дисрегуляция активности ма-триксных металлопротеиназ (ММР).

Глутаматная эксайтотоксичность представляет собой патологический процесс, при котором происходит избыточное высвобождение глутамата в синаптическую щель, что приводит к гиперстимуляции NMDA-рецепторов постсинаптической мембраны. Развитие оксидативного стресса и митохондриальной дисфункции являются неразрывно связанными звеньями вторичного повреждения [5]. В условиях ЧМТ наблюдается избыточная продукция митохондриального пероксида водорода (MitoH2O2) при одновременном истощении эндогенных антиоксидантных систем. Митохондрии, являясь основными источниками активных форм кислорода (АФК) и одновременно ключевыми регуляторами энергетического метаболизма, особенно уязвимы при ЧМТ. Повреждение митохондриальных мембран приводит к разобщению дыхательной цепи, снижению интенсивности аэробного окисления и переключению клеточного метаболизма на менее эффективный анаэробный путь, что сопровождается накоплением лактата и дальнейшим усугублением энергетического дефицита.

Нейровоспаление при ЧМТ характеризуется активацией микроглии и астроцитов, которые начинают секретировать широкий спектр провоспалительных цитокинов. Ключевым медиатором нейровоспаления является фактор некроза опухоли-α (TNFα). ММР, в частности ММР-2 и ММР-9, представляют собой семейство цинк-зависимых эндопептидаз, участвующих в деградации компонентов внеклеточного матрикса и базальных мембран. При ЧМТ наблюдается дисрегуляция активности ММР-2, что приводит к деградации белков плотных контактов (клаудинов, окклюдинов) и, как следствие, к нарушению целостности гематоэнцефалического барьера. Это способствует вторичной инфильтрации иммунных клеток в паренхиму мозга, усилению отека и нейровоспаления [6].

На фармацевтическом рынке присутствуют нейропротекторы с различными механизмами действия, однако их сравнительная эффективность при ЧМТ изучена недостаточно. Мемантин является неконкурентным антагонистом NMDA-рецепторов. В настоящее время проводятся клинические исследования по оценке эффективности мемантина у пациентов с легкой и умеренной ЧМТ, включая влияние на когнитивные функции и сывороточные биомаркеры повреждения (S-100β) [7]. Однако экспериментальные данные демонстрируют неоднозначность эффектов мемантина: при определенных моделях повреждения раннее введение мемантина может потенцировать нейродегенеративные процессы [8].

Холина альфосцерат и цитиколин выступают в качестве предшественников ацетилхолина и мембранных фосфолипидов. Современные систематические обзоры подтверждают эффективность холина альфосцерата и цитиколина у пациентов с деменцией и когнитивными нарушениями, что может быть релевантно и для посттравматического периода [9].

Этилметилгидроксипиридина сукцинат (ЭМГПС) – антиоксидантный препарат, стабилизирующий митохондриальные мембраны. Исследования показывают, что ЭМГПС способен модулировать экспрессию генов, вовлеченных в митохондриальную биогенетику (PGC-1α) и стресс-ответ (GR, SUCNR1), что обосновывает его нейро-протекторный потенциал [10]. Результаты клинических испытаний также подтверждают эффективность и безопасность применения ЭМГПС у пациентов с ишемическим инсультом, что косвенно указывает на его церебропро-тективные свойства [11]. На основании вышесказанного актуальным является проведение исследовательской работы в рамках единого дизайна для сравнительной оценки влияния мемантина, холина альфосцерата, цитиколина и ЭМГПС на интегральные показатели оксидативного стресса (MitoH2O2), нейровоспаления (TNFα), эксайтоток-сичности (глутамат), активности ММР-2 и энергетического метаболизма при ударно-контузионной ЧМТ (УК-ЧМТ).

Цель исследования: в условиях эксперимента провести сравнительную оценку нейропротекторного действия мемантина, холина альфосцерата, цитиколина и ЭМГПС на УК-ЧМТ у крыс по показателям оксидативного стресса, нейровоспаления, эксайтотоксичности, активности ММР-2 и энергетического обмена.

Материал и методы

Эксперименты были выполнены на 60 половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 200–220 г, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполо-во». Животные содержались в стандартных условиях вивария (температура – 22–24 °C, влажность – 55–75%, 12-часовой цикл день/ночь) с неограниченным доступом к воде и стандартному гранулированному корму. Все манипуляции соответствовали международным нормам экспериментальной этики, представленным в Директиве 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях, и Рекомендациям Коллегии ЕЭК от 14.11.2023 г. № 33 «О Руководстве по работе с лабораторными (экспериментальными) животными при проведении доклинических (неклинических) исследований». Работа получила одобрение независимого этического комитета (протокол рассмотрения № 4 от 10.06.2025 г.), результаты представлены согласно рекомендациям, ARRIVE guidelines 2.0 [12].

Все экспериментальные животные были рандомизированы по массе тела и разделены на 6 эксперимен- тальных групп, по 10 особей в каждой: ложноопериро-ванные (ЛО), негативный контроль (НК), а также группы, получавшие мемантин, холина альфосцерат, цитиколин и ЭМГПС. Животным воспроизводили УК-ЧМТ. Моделирование УК-ЧМТ осуществляли под хлоралгидратной анестезией (350 мг/кг, внутрибрюшинно) с использованием установки для нанесения дозированной механической травмы. В теменную область черепа наносили удар свободно падающим грузом массой 50 г с высоты 25 см на площадку-боек, расположенную на левой теменной кости. Энергия удара составляла 0,125 Дж.

После моделирования, на 2-е сут, начинали введение исследуемых соединений со 2-х по 8-е сут (7 дней). Способ введения был фиксированным для каждого исследуемого вещества (пероральный). Мемантин, холина альфосцерат, цитиколин и ЭМГПС вводили в виде тонкодисперсной водной суспензии в дозах 20 мг/кг [6], 50 мг/ кг, 250 мг/кг [6] и 50 мг/кг [1] соответственно.

По завершении эксперимента через 24 ч после последнего введения веществ животным проводили оценку когнитивных функций в тесте Y-образный лабиринт [13]. Установка представляла собой три рукава, соединенных под углом 120°. Крысу помещали в центр лабиринта и в течение 2 мин регистрировали последовательность заходов в рукава. Спонтанным чередованием считали последовательность из трех различных заходов (например, 1-2-3). Рассчитывали процент спонтанного чередования.

После оценки когнитивного статуса животных выводили из эксперимента путем декапитации под хлоралгидрат-ной анестезией (350 мг/кг, внутрибрюшинно) и проводили забор биоматериала. Головной мозг быстро извлекали, помещали на ледяную баню (0–4 °C). Образцы гомогенизировали в буферном растворе (pH 7,4) и центрифугировали 2 мин при 1 100 g. Супернатант использовали для определения концентрации MMP-2, TNFα и глутамата. Для оценки содержания MitoH2O2 и анализа клеточного дыхания дополнительно выделяли митохондриальную фракцию методом дифференциального центрифугирования с использованием перколлового градиента [1]. Концентрации TNFα, глутамата и ММР-2 в супернатанте головного мозга измеряли с помощью коммерчески до- ступных наборов твердофазного иммуноферментного анализа производства Cloud Clone corp. (КНР). Анализ выполняли согласно инструкции производителя, прилагаемой к каждому набору. Оптическую плотность регистрировали при 450 нм на планшетном ридере Infinite F50 (Tecan, Австрия).

MitoH2O2 определяли с использованием набора Amplex Red (ThermoFisher Scientific, Германия) флуоресцентным методом (λвозб = 530 нм, λисп = 590 нм). Результаты выражали в ммоль/л. Интенсивность аэробного клеточного дыхания определяли по изменению потребления кислорода в анализируемой среде при добавлении 4-(трифлуорометокси)фенил)гидразоно)малононитрила в концентрации 1 µM/л и пирувата (15 ммоль/л) в качестве субстрата. Активность анаэробного обмена оценивали по изменению pH при внесении в среду олигомицина (1 µг/ мл) и глюкозы (15 ммоль/л) в качестве субстрата [14, 15].

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета StatPlus 7.0 (AnalystSoft Inc., США, лицензия 16887385). Данные проверяли на нормальность распределения по критерию Шапиро – Уилка. Для межгрупповых сравнений количественных показателей, подчиняющихся закону нормального распределения, в шести независимых группах применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с попарными апостериорными сравнениями по критерию Тьюки. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез составлял 0,05.

Результаты

При проведении сравнительного анализа по результатам теста Y-образный лабиринт (рис. 1) между НК-группой и группой ЛО было установлено снижение когнитивных функций, составившее –68,5% ( p < 0,05). На фоне введения исследуемых веществ наиболее выраженный эффект восстановления когнитивных функций при сравнении с НК-группой отмечался при применении ЭМГПС – на 103% ( p < 0,05). Другие соединения в меньшей степени оказывали данный эффект: холина альфосцерат – на 84,2% ( p < 0,05), мемантин – на 81,4% ( p < 0,05) цитиколин – на 79,4% ( p < 0,05).

ЛО                 НК              Мемантин        Хотина альфосцерат Цитиколин            ЭМГПС

Рис. 1. Результаты теста Y-образный лабиринт у крыс с ударно-контузионной черепно-мозговой травмой на фоне введения нейропротекторов

Fig. 1. Y-maze test results in rats with contusion traumatic brain injury following administration of neuroprotectors

В ходе экспериментальной работы при межгрупповом сравнении показателей НК-группы крыс (таблица) с группой ЛО было установлено статистически значимое повышение средних уровней таких показателей, как содержание TNFα – на 261,8% ( p < 0,05), MitoH₂O₂ – на 92,3% ( p < 0,05), глутамат – на 73,2% ( p < 0,05), интенсивность анаэробного метаболизма – на 146,7% ( p < 0,05) и снижение аэробного метаболизма – на 56,1% ( p < 0,05), концентрации ММР-2 – на 81,8% ( p < 0,05).

При курсовом введении мемантина отмечалось отклонение в проценте повышения уровня TNFα и снижения MitoH₂O₂ без статистически значимых различий ( p > 0,05). Также применение мемантина способствовало снижению средних уровней: глутамата – на 31,3% ( p < 0,05), анаэробного метаболизма – на 29,7% ( p < 0,05), ММР-2 – на 25,6% ( p < 0,05) по сравнению с НК-группой. Наряду с этим мемантин при сравнении с показателями НК-группы крыс вызывал повышение средней интенсивности аэробных реакций на 29,7% ( p < 0,05).

Применение холина альфосцерата при сравнении с НК-группой вызывало незначительное изменение концентрации TNFα, глутамата и активности MitoH₂O₂ и анаэробного метаболизма, но значимость различий между группами не превысила уровня случайной вариации ( p > 0,05). Средние уровни ММP-2 и интенсивности аэробного метаболизма составили -30,2% и +37% ( p < 0,05) от НК соответственно.

У группы животных, получавших цитиколин, при сравнении с НК-группой не было установлено статистически значимых различий ( p > 0,05) при определении средних уровня глутамата и активности MitoH₂O₂, в то время как средние концентрации TNFα и ММP-2 снижались: на 22,9% ( p < 0,05) и на 29,3% ( p < 0,05) соответственно. При этом средняя активность анаэробного метаболизма снижалась на 27% ( p < 0,05), а средняя активность аэробного обмена повышалась на 31,5% ( p < 0,05) от аналогичного показателя НК-группы.

На фоне введения ЭМГПС при сопоставлении с НК-группой по показателю анаэробного метаболизма отсутствовали устойчивые статистически значимые различия ( p > 0,05). Для остальных параметров отмечена тенденция к снижению средних уровней показателей в сравнении с НК-группой животных: TNFα – на 20,6% ( p < 0,05), MitoH₂O₂ – на 42,3% ( p < 0,05), глутамат – на

26% ( p < 0,05), ММР-2 – на 29,3% ( p < 0,05), тогда как средняя интенсивность аэробного обмена увеличилась на 50% ( p < 0,05).

Обсуждение

ЧМТ остается одной из ведущих причин инвалидизации, временной и стойкой утраты трудоспособности, а также смертности среди лиц молодого и трудоспособного возраста, занимая первое место среди всех повреждений центральной нервной системы по совокупным показателям социально-экономического ущерба [1, 2]. По данным глобального бремени болезней (GBD 2019), ежегодно более 69 млн человек во всем мире переносят ЧМТ любой степени тяжести, причем УК-ЧМТ составляют значительную долю госпитализаций в нейрохирургические стационары. Распространенность ЧМТ в популяции достигает 150–250 случаев на 100 000 населения в развитых странах, а в регионах с высоким уровнем дорожно-транспортного травматизма и вооруженных конфликтов эти показатели возрастают в 2–3 раза [2]2.

Особую медико-социальную значимость проблеме придает тот факт, что даже при своевременном оказании первичной помощи у значительной части пациентов формируются отдаленные посттравматические последствия. Согласно метаанализам, риск развития посттравматической деменции увеличивается в 1,5–4 раза, болезни Паркинсона – в 1,7–2,9 раза, а посттравматической эпилепсии – в 5–10 раз по сравнению с общей популяцией [3, 4]. Патофизиологической основой этих исходов служит вторичное повреждение головного мозга, разворачивающееся в отсроченном периоде после первичного механического удара. Именно вторичное повреждение, включающее каскад оксидативного стресса, глутаматной эксайтотоксичности, нейровоспаления, дисфункции митохондрий и протеолиза внеклеточного матрикса, является основной мишенью для фармакологической нейропротекции [3, 5].

Несмотря на многолетние усилия, специфическая патогенетически обоснованная терапия ЧМТ до настоящего времени не разработана. В настоящем исследовании впервые проведена сравнительная оценка нейропро-текторной эффективности четырех фармакологических агентов с различными механизмами действия (мемантина, холина альфосцерата, цитиколина и ЭМГПС) на

Таблица . Различия в результатах применения мемантина, холина альфосцерата, цитиколина и этилметилгидроксипиридина сукцината на показатели нейровоспаления (TNFα), оксидативного стресса (MitoH₂O₂), эксайтотоксичности (глутамат), активности матриксной металлопротеиназы-2 (ММР-2), аэробного и анаэробного метаболизма в головном мозге крыс с ударно-контузионной черепно-мозговой травмой ( M±SE )

Table . Effects of memantine, choline alfoscerate, citicoline and ethylmethylhydroxypyridine succinate on neuroinflammation (TNFα), oxidative stress (MitoH₂O₂), excitotoxicity (glutamate), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) activity, aerobic and anaerobic metabolism in the brains of rats with contusion traumatic brain injury ( M±SE )

Группы	TNF, пг/мл	MitoH2O2, ммоль/л	Глутамат, нг/мл	Аэробный метаболизм, ppm/мин/мг белка	Анаэробный метаболизм, pH/ppm/мин	ММP-2, нг/мл
ЛО	68,3±6,7	0,2±0,1	15,3±2	12,3±0,1	1,5±0,2	4,4±1,6
НК	247,1±20,3#	2,6±0,3#	26,5±2,8#	5,4±0,2#	3,7±0,3#	24,2±2,1#
Мемантин	200,8±9	2,6±0,2	18,2±2,4*	6,9±0,8*	2,6±0,3*	18±1,5*
Холина альфосцерат	198,5±11	2,5±0,2	22,4±1,1	7,4±0,2	3±0,3*	16,9±1,6*
Цитиколин	190,5±11,8*	2,5±0,2	23,6±1,2	7,1±0,1*	2,7±0,4*	17,1±1,5*
ЭМГПС	196,3±10,7*	1,5±0,2*	19,6±2,8*	8,1±0,3	3,1±0,3*	17,6±1,6*

Примечание: # – статистически значимо относительно группы ложнооперированных животных (критерий Тьюки), * – статистически значимо относительно группы негативного контроля (критерий Тьюки), ЛО – ложнооперированные животные, НК – негативный контроль.

1 World Health Organization. Neurological disorders: public health challenges. Geneva: WHO; 2023:312.

интегральные показатели оксидативного стресса, нейровоспаления, эксайтотоксичности, активности ММР-2 и энергетического метаболизма при УК-ЧМТ у крыс.

Актуальность данного сравнительного анализа обусловлена частичной нехваткой работ такого спектра, которые были бы выполнены в рамках единого дизайна, что неоднократно отмечалось как ключевой пробел в области экспериментальной нейрофармакологии [3, 6]. Воспроизведенная УК-ЧМТ в эксперименте привела к закономерному развитию вторичного повреждения головного мозга, что подтверждается статистически значимым повышением средних значений исследуемых показателей в эксперименте биомаркеров патогенетического каскада: уровня TNFα – на 261,8%, глутамата – на 73,2%, MitoH₂O₂ – на 92,3%, ММР-2 – на 81,8%, а также усилением анаэробного метаболизма на 146,7% и снижением аэробного дыхания на 56,1% в НК-группе по сравнению с ЛО группой ( p < 0,05).

Эти изменения полностью согласуются с современными представлениями о патофизиологии ЧМТ, согласно которым ключевую роль играют глутаматная экс-айтотоксичность, оксидативный стресс с избыточной продукцией митохондриальных активных форм кислорода, митохондриальная дисфункция и нейровоспаление, опосредованное активацией микроглии и астроцитов [3, 5, 6]. Особого внимания заслуживает выявленное повышение активности ММР-2, которое, как показано ранее, приводит к деградации белков плотных контактов гематоэнцефалического барьера и способствует вторичной инфильтрации иммунных клеток в паренхиму мозга [6]. Наибольший восстановительный эффект в отношении когнитивных функций, оцененный в тесте Y-образный лабиринт, продемонстрировал ЭМГПС (повышение правильных ответов на 103% относительно НК, p < 0,05), что превосходило показатели холина альфосцерата (+84,2%), мемантина (+81,4%) и цитиколина (+79,4%).

Этот результат коррелирует с его способностью наиболее эффективно снижать средний уровень MitoH₂O₂ (на 42,3% относительно НК, p<0,05) и глутамата (на 26%, p < 0,05), а также восстанавливать аэробный метаболизм (повышение на 50%, p<0,05). В то же время отсутствие значимого влияния ЭМГПС на анаэробный метаболизм (различия с НК незначимы, p > 0,05), это может указывать на преимущественное действие препарата на митохондриальное дыхание, а не на гликолиз. Мемантин, несмотря на свое известное антиэксайтотоксическое действие через неконкурентную блокаду NMDA-рецепторов с умеренным сродством [6, 7], не привел к статистически значимому снижению среднего уровня TNFα и MitoH₂O₂ ( p > 0,05). Тем не менее в нашем исследовании мемантин статистически значимо снижал средние уровни глутамата (на 31,3%, p < 0,05), ММР-2 (на 25,6%, p < 0,05) и активность анаэробного обмена (на 29,7%, p < 0,05), что согласуется с данными о его способности стабилизировать гематоэнцефалический барьер и снижать протеолиз внеклеточного матрикса [6].

Холина альфосцерат и цитиколин, выступающие в качестве предшественников ацетилхолина и мембранных фосфолипидов, показали сходную, но не идентичную картину нейропротекции. Холина альфосцерат наиболее эффективно снижал уровень ММР-2 (на 30,2%, p < 0,05) и повышал аэробный метаболизм (на 37%, p < 0,05), однако не оказывал статистически значимого влияния на TNFα, глутамат, MitoH₂O₂ и анаэробный обмен ( p > 0,05).

Цитиколин, напротив, вызывал статистически значимое снижение TNFα (на 22,9%, p < 0,05), ММР-2 (на 29,3%, p < 0,05) и анаэробного метаболизма (на 27%, p < 0,05), но не влиял на средний уровень глутамата и MitoH₂O₂ ( p > 0,05). Эти различия могут объясняться тем, что цитиколин обладает дополнительным антиоксидантным действием, связанным с восстановлением кардиолипина в митохондриальных мембранах и снижением продукции АФК, тогда как холина альфосцерат в большей степени поддерживает структурную целостность липидного бислоя нейрональных мембран и оптимизирует синаптическую передачу [6, 9].

Полученные результаты согласуются с данными систематического обзора, подтверждающего эффективность обоих препаратов при когнитивных нарушениях, однако на нашей модели ЧМТ цитиколин продемонстрировал более широкий спектр действия, включая противовоспалительный эффект [9]. Важно отметить, что ни один из исследуемых препаратов полностью не нормализовал изученные показатели до уровня ложнооперированных животных, что подчеркивает сложность и многокомпо-нентность вторичного повреждения при ЧМТ. Этот вывод согласуется с мнением ведущих экспертов в области нейропротекции, согласно которому монотерапия одним препаратом вряд ли сможет полностью блокировать все звенья патофизиологического каскада, и перспективным направлением является комбинированное применение агентов с комплементарными механизмами действия [3, 7].

Наиболее сбалансированное действие по всем изученным параметрам (от оксидативного стресса до энергетического метаболизма) показал ЭМГПС, что позволяет рассматривать его как наиболее перспективное средство для дальнейших доклинических и клинических исследований при УК-ЧМТ. Полученные нами экспериментальные данные косвенно подтверждаются результатами клинических испытаний ЭМГПС у пациентов с ишемическим инсультом, где также была продемонстрирована его церебропротективная эффективность и благоприятный профиль безопасности [11].

Заключение

Проведенное экспериментальное исследование позволило впервые в рамках единого дизайна провести сравнительную оценку нейропротекторной эффективности четырех фармакологических агентов с различными механизмами действия (мемантина, холина альфосцерата, цитиколина и ЭМГПС) при УК-ЧМТ у крыс. Установлено, что все исследуемые соединения в той или иной степени снижают выраженность вторичного повреждения головного мозга, однако степень их влияния на ключевые патофизиологические звенья (оксидативный стресс, нейровоспаление, эксайтотоксичность, активность ММР-2, энергетический обмен) существенно различается.

Наиболее сбалансированное и выраженное нейро-протекторное действие продемонстрировал ЭМГПС, который эффективно снижал уровень митохондриального пероксида водорода, глутамата, TNFα и ММР-2, восстанавливал аэробный метаболизм и когнитивные функции. Это позволяет рассматривать ЭМГПС как наиболее перспективное средство для дальнейших доклинических и клинических исследований при УК-ЧМТ.

Полученные результаты указывают на целесообразность изучения комбинированной терапии (например,

ЭМГПС с цитиколином или мемантином) с целью потенцирования нейропротекторного эффекта за счет воздействия на различные звенья патогенеза. Перспективными направлениями также являются исследование дозозависимых эффектов, определение терапевтического окна и оценка влияния препаратов на отдаленные посттравма-