Сравнительная оценка действия ионов меди на редис в культуре in vitro и in vivo

В статье сравнивается реакция редиса in vitro и in vivo на воздействия различных концентраций ионов меди. Показано влияние различных концентраций меди на антиоксидантные ферменты в культуре клеток и растений. Показано, что ионы Сиг+ оказывают более сильное влияние на проростки редиса, чем на каллусную культуру. Выявлено, что активность основных антиоксидантных ферментов в растениях и каллусе редиса обычно возрастала при действии ионов меди. При изучении зависимости скорости генерации супероксидного анион-радикала от содержания ионов Си2+ в среде можно видеть, что уровень АФК возрастал относительно контроля как в каллусах, так и в растениях. Интенсивность ПОЛ в каллусах редиса и растениях, выращенных на питательной среде с добавлением ионов меди, по отношению к контролю изменялась незначительно.

На растения в естественной среде обитания действует ряд факторов внешней среды, включая неблагоприятные температуры, засоление, засуху, ионизирующее излучение, ультрафиолетовые лучи, тяжелые металлы. Многие факторы среды, к которым растение эволюционно не приспособлено, могут оказывать стрессовое воздействие на организм, приводящее к различным физико-химическим аномалиям в клетках растений, повреждению их структур и метаболических функций, снижению или полному подавлению образования органического вещества [8). Для изучения влияния на растительные объекты стрессовых факторов удобно использовать метод культуры клеток, который связан с выращиванием in vitro отдельных частей и органов растений на питательных средах в асептических условиях. Таким образом можно задавать различные параметры, адекватные тем, в каких позже придется жить взрослым растениям, в том числе экстремальные условия выращивания [7].

При использовании методов микроразмножения in vitro одновременно проводят повышение устойчивости растений к стрессам и выведение высококачественных сильных микрорастений [14). В настоящее время методы in vitro применяют в селекции на солеустойчивость [11]. При анализе профилей экспрессии в условиях стресса, вызванного засухой в культуре in vitro, идентифицированы гены, отвечающие за засухоустойчивость, и получены растения, толерантные к экологическим стрессам [13].

В результате расширяющегося промышленного производства наблюдается прогрессирующее насыщение биосферы тяжелыми металлами (ТМ) [2], Возрастание их поступления в окружающую среду приводит к загрязнению почвы, откуда избыточные количества ТМ попадают в растения [8], вызывая серьезные нарушения растений на уровне клетки, ткани, организма, популяции [10]. Одним из наиболее токсичных для растений тяжелым металлом является медь [1]. Токсичность ионов меди проявляется в торможении роста корней и побегов, хлорозах, засыхании нижних листьев. Высокие концентрации меди приводят к гибели растений [5]. В то же время физиологические и биохимические механизмы токсического действия ионов меди, особенно на клеточном уровне, изучены недостаточно.

Цель работы состояла в сравнении реакции редиса на стрессовые воздействия различных концентраций ионов меди в условиях in vitro и in vivo.

В качестве объекта исследования был выбран редис Raphanus sativus L. «красный великан». Стерильные растения получали по методике, приведенной ранее в [3], далее из них вычленяли экспланты, на которых после посадки на питательную среду Мурасиге — Скуга (МС) формировалась каллусная ткань [3]. Пятинедельные каллусы, полученные на разных эксплантах, и семидневные стерильные растения пересаживали на среду МС с добавлением различных концентраций (от 10"⁵ до 10^-3 М/л)

CuSO4 x 5Н2О. После этого измеряли динамику изменений активности каталазы, ас-корбат-пероксидаэы (АПО), супероксиддис-мутазы (СОД), а также скорость генерации супероксидного анион-радикала (Ор и интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по методикам, приведенным в [6].

При анализе действия различных концентраций Си2* на активность каталазы в листьях редиса выявлено, что все исследованные дозы металла достоверно повышали активность фермента (рис. 1, в). При этом самая малая концентрация ионов Си2*

(10 мкМ) индуцировала значительное увеличение активности каталазы (на 83 %). С увеличением концентрации Си2* активность каталазы превышала контроль на 77 и 32 % для доз 0,1 и 1 мМ соответственно. Это было несколько ниже относительно самой малой концентрации ТМ.

В каллусной культуре редиса активность каталазы изменялась почти так же, как в листьях растений. Так, она достигала максимального значения при концентрации ионов меди 10 мкМ; в то же время самое малое увеличение активности, индуцированное ионами Си2*, отмечено при концентрации 0,1 мМ (рис. 1, б).

1 мМ

Концентрация                                  Концентрация а                                                                                    6

Рисунок 1

Активность каталазы при действии различных концентраций ионов Си2*: а — в семядольных листьях семидневных проростков редиса

6 — в пятинедельной каллусной культуре редиса

Активность СОД также достигала наибольшего значения в варианте с добавлением в среду 10 мкМ CuSO₄ (увеличение к уровню контроля на 32 и 19 % для растений и каллусов соответственно) (рис. 2). При этом наблюдали различия поведения фермента в семядольных листьях и каллусной ткани при действии ионов Си²*. Так, у растений редиса с повышением дозы меди в среде активность СОД снижалась (на 27 и 4 % по отношению к контролю при концентрациях 0,1мМ и 1 мМ соответственно) (рис. 2, а). В то же время в каллусах редиса активность СОД резко и почти линейно снижалась при увеличении концентрации CuSO₄ в среде выращивания (рис. 2, б). Это может указывать на быстрое развитие окислительного стресса в клетках каллусной ткани, особо выраженного при высоких концентрациях ТМ [7].

При изучении АПО в растениях редиса выявлена зависимость активности фермента от концентрации металла — она резко возрастала при концентрации 10 мкМ (на 57 % к контролю) и затем снижалась с увеличением концентрации CuSO₄ (рис. 3, а). Активность АПО в каллусе редиса возрастала по сравнению с контролем при всех изученных концентрациях ионов Си³*, наиболее значительно — в концентрациях 10 мкМ и 1 мМ (рис. 3, б).

При изучении зависимости скорости генерации супероксидного анион-радикала от содержания ионов Сц2* в среде можно видеть, что уровень АФК возрастал относительно контроля во всех вариантах опыта (рис. 4). Наибольшее увеличение данного показателя в растениях редиса достигалось при концентрации 10 мкМ, возрастание составило 131 % к контролю (рис. 4, d\ Оче- видно, что все концентрации тяжелого металла (меди) индуцировали возникновение окислительного стресса у растений редиса; при этом невысокие дозы металла (0,1 и 10 мкМ) усиливали генерацию АФК в наибольшей степени.

Скорость генерации OJ в каллусе редиса возрастала относительно контроля при двух концентрациях меди и была наиболь шей (повышена на 34 % к уровню контроля) при концентрации 10 мкМ (рис. 4, б); наименьший показатель зафиксирован у каллуса, выращенного на среде с концентрацией Си2*, равной 0,1 мМ. Можно предположить, что ионы Си2+ не вызывали ярко выраженного окислительного стресса в кал-лусной культуре редиса.

а

Рисунок 2

Активность СОД при действии различных концентраций ионов Си2*; а — в семядольных листьях семидневных проростков редиса 6 — в пятинедельной каллусной культуре редиса

Рисунок 3

Активность АПО при действии различных концентраций ионов Си1*; а — в семядольных листьях семидневных проростков редиса б — в пятинедельной каллусной культуре редиса

Рисунок 4

Скорость генерации супероксидного анион-радикала при действии различных концентраций ионов Си2*: а — в семядольных листьях семидневных проростков редиса 6 — в пятинедельной каллусной культуре редиса

10 мкМ 0,1 мМ 1 мМ

Концентрация

При изучении интенсивности ПОЛ в растениях редиса было установлено, что этот показатель при всех дозах ионов меди в среде изменялся относительно контроля очень незначительно — не более 5 % (рис. 5, а). Усиление ПОЛ является показателем повреждения ненасыщенных мембранных липидов и, следовательно, клеточных мембран [8].

Рисунок 5

Интенсивность ПОЛ при действии различных концентраций ионов Си2*: а — в семядольных листьях семидневных проростков редиса б — в пятинедельной каллусной культуре редиса

Интенсивность ПОЛ в каллусах редиса, выраженных на питательной среде с добавлением ионов меди, не превышала значения контроля. Очевидно, что ионы Си2+ не оказали значительного отрицательного влияния на культуру клеток, как можно видеть из определений этого показателя. Это позволяет сделать выводы о том, что ионы Си2+ ока зывают более сильное влияние на проростки редиса, чем на каллусную культуру. Активность основных антиоксидантных ферментов в растениях и каллусе редиса обычно возрастала при действии ионов меди. Максимальное увеличение активности СОД, АПО и каталазы наблюдали при минимальной дозе Сп2+ меди в среде (10 мкМ). Дей- ствие ионов меди на активность антиоксидантных ферментов выражено сильнее у проростков in vivo по сравнению с каллусами in vitro. Возможно, это связано с отсутствием дальнего транспорта ионов меди, как это происходит в целом растении; отсутствием надклеточного уровня регуляции, на который не влияют ионы Си2*; отсутствием тканей, избирательно поглощающих тяжелые металлы; а также может быть связано с результатом адаптации на клеточном уровне к избыточным дозам тяжелых металлов в среде, что возможно использовать при скрининге форм растений на устойчивость к ТМ [5].