Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики грибковых заболеваний кожи и мягких тканей

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 616.5:616-07                                  

Поверхностные микозы и микозы мягких тканей являются одними из наиболее распространенных заболеваний в практике врачей-дерматологов [2, 4].

В структуре кожной патологии заболеваемость грибковыми поражениями кожи продолжает занимать лидирующее положение: по разным данным на долю микозов приходится от 37% до 42% всех заболеваний кожи, ногтей и слизистых оболочек [3, 5].

Одним из путей снижения уровня заболеваемости микозами кожи и мягких тканей является необходимость изучения специфических для каждого региона эпидемиологических условий, степени урбанизации, условий работы, клинических особенностей с целью повышения эффективности борьбы с микозами [1, 8].

В большинстве случаев микозы кожи и мочеполовой системы являются основными источниками распространения грибковой инфекции среди населения [7].

Микозы кожи и мягких тканей оказывают негативное воздействие на качество жизни и общее состояние здоровья больных, поражая наиболее трудоспособное население, и делают эту проблему не только медицинской, но и социально-экономической [6, 8].

Отсюда возникает практическая необходимость оценить наиболее широко используемых методов исследования для точного определения грибковых заболеваний и назначить наиболее эффективных лекарственных препаратов для лечения, обладающих широким спектром биологической активности [6].

Целью данной работы является, изучение и оценка эффективности современных методов для точного выявления данных заболеваний.

Материалы и методы исследований

Научно-практические исследования по изучению грибковых заболеваний кожи и мягких тканей у людей выполнены на базе кафедры Общей биологии, экологии и лабораторного дела и в Республиканском центре дерматовенерологии. Объектом исследования являлись люди разного возраста с грибковыми заболеваниями кожи, головы, ногтей, паховой зоны, мочеполовой системы и ЛОР органов. Материалом для исследования послужили биоматериалы (соскоб из кожи, мочеполовой системы, рото-носоглотки) полученные после врачебного осмотра в процедурном кабинете, с предварительным клиническим диагнозом – микоз. Для исследования грибковых заболеваний кожи и мягких тканей были использованы следующие методы: микроскопические, молекулярные и микробиологические методы исследований.

Результаты и их обсуждения

Оценка микроскопических методов для диагностирования грибковых заболеваний. Для оценки ключевых критерий микроскопического метода при выявлении возбудителей грибковых заболеваний, были использованы 260 проб полученные от людей с подозрением микоза кожи и мягких тканей. Определение типов микозов проводилась на основании биоматериалов, полученных от детей раннего возраста до лиц пожилого возраста, обратившихся в РЦДВ в 2024 г. Микроскопический метод при диагностирования грибковых заболеваний является наиболее доступными и простыми способами.

Для исследования взятые пробы под микроскопом можно рассматривать в неокрашенных (нативных) и окрашенных препаратах. При микроскопическом исследовании пораженного грибом часто можно определить родовую принадлежность дерматофита. Здесь можно увидеть споры, гифы грибов. Данный метод быстро подтвердить микоз, но вид возбудителя и его количественная концентрация определить под микроскопом в основном невозможно. Микроскопическим методом определяется факт заражения микозом. Точнее микроскопический метод обладает низкой специфичностью до 29%, так как не позволяет идентифицировать видовую принадлежность возбудителя грибковых заболеваний, чувствительность данного метода высокая варьируется в пределах 87-91%. Время выполнения исследования возбудителей грибковых заболеваний зависит от типа исследования. Прямая микроскопия длится до 1-2 часов, выдача результатов в течении рабочего дня. Данный анализ в лабораторных условиях делается квалифицированными врачами-лаборантами или лаборантами. Специфичность метода микроскопии в руках опытного врача-лаборанта или лаборанта достигает 100%.

Методы микроскопического исследования можно использовать для выявления подозрений на грибковые заболевания и назначения соответствующего лечения. При этом, как говорилось ранее, возбудитель заболевания четко не выявляется, но определяется наличие или отсутствие грибкового заболевания, и на основании предполагаемых результатов проводится лечение.

Оценка молекулярных методов для диагностирования грибковых заболеваний. Для определения возбудителей грибковых заболеваний молекулярным методом или методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени используются следующие ПЦР тесты: «АндрофлорСкрин», «ФемофлорСкрин», «АмплиПрайм Дерматофиты». Набор реагентов «АмплиПрайм Дерматофиты» используется в клинической лабораторной диагностике для исследования биологического материала, полученного от лиц с подозрением на микозы, вызываемые дерматофитами ( Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes complex, Trichophyton tonsurans, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis ). Набор применяется только для диагностики выше перечисленных видов грибов. Так как ПЦР тесты определяют только определенные виды грибов, с помощью теста «АмплиПрайм Дерматофиты» мы могли определить только несколько видов микоза кожи, головы и ногтей.

В результате проведения ПЦР теста «АмплиПрайм Дерматофиты» на 20 образцов были получены следующие результаты (Таблица 1).

Таблица 1 РЕЗУЛЬТАТЫ ПЦР ТЕСТА «АМПЛИПРАЙМ ДЕРМАТОФИТЫ»

ПРОВЕДЕННЫЕ НА БИОМАТЕРИАЛОВ, ВЗЯТЫХ ИЗ КОЖИ, ВОЛОС И НОГТЕЙ (Результаты ПЦР теста - ДНК вида обнаружены)

Возбудители микоза	Количество образцов
Эпидермофития паховая Epidermophyton floccosum	7
Эпидермофития стоп Trichophyton mentagrоphytes var. interdigitale.	6
Эпидермофития ногтей (онихомикоз) Trichophyton mentagrophytes Trichophyton rubrum	9
Руброфития Trichophyton rubrum	8
Трихомикоз М. canis	9

Как показано в Таблице 1, паховая эпидермофития была идентифицирована в 7 из 20 анализов, эпидермофития стоп выявлено из 6 образцов, онихомикоз – 9, руброфития – 8, трихомикоз – 9. В 93% из 20 анализов, взятых с волос, кожи и ногтей, выявлен микоз и его возбудители. В результате проведенных исследований чувствительность данного теста составлял 67-93%, специфичность 38-78%. Сравнительно низкая специфичность связана с тем, что результат ПЦР может быть положительным даже в том случае, когда возбудители микоза нежизнеспособен, т.е., ПЦР тесты чувствительны к ДНК мертвых возбудителей.

Во время исследований с помощью теста «Андрофлор и ФемофлорСкрин» мы определяли видовой состав дрожжеподобных грибов Candida spp. Для этого были использованы биоматериалы, соскобы, полученные из мочеполовой системы.

Во время анализа из образцов выявили несколько видов Candida spp. Результаты приведены в Таблице 2.

Таблица 2

РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТА «АНДРОФЛОР И ФЕМОФЛОРСКРИН»

ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КАНДИДОЗА МОЧЕПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ

Виды Candida	Результаты	Количественный результат
C. аlbicans	обнаружено	104,7–105
С. Stellatoidea	не выявлено	-
C. pelliculosa	обнаружено	102,9–104,3
C. parapsillosis	обнаружено	103,7–104,8
C. humicula	не выявлено	-
C. intermedia	обнаружено	104,0–104,9
C. brumpti	выявлено	102,1–103,2
C. guilliermondii	не выявлено	-
C. krusei	обнаружено	104,3–105

Таблица 3

РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР ТЕСТА «МИКОЗОСКРИН» ПРИ ВЫЯВЛЕНИЯ ГРИБКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Виды микоза	Возбудители	Результаты, в%
Кератомикоз	Malassezia furfur	34,9
Кандидоз кожи и	Candida albicans	43,8
мягких тканей	C. tropicalis	8,12
	C. parapsilosis	14,1
	C. glabrata	28,9
	С. Dubliniensis	3,75
	C. guilliermondii	1,98
Дерматофития	Эпидермофития паховая Epidermophyton floccosum	48,1

Как показано в Таблице 2, ПЦР тесты «Андрофлор и ФемофлорСкрин» используются только для определения кандидоза, тесты выявляет узкий спектр грибковых заболеваний. В наших анализах были выявлены 6 видов кандид. Чувствительность данного теста составляет 93-98%, специфичность – 96%. Точнее данный тест точно определяет вид кандидоза. Во время проведения ПЦР теста «МикозоСкрин» в образцах были определены следующие виды возбудителей грибковых заболеваний, которые приведено в Таблице 3.

ПЦР тесты показывают узкую видовую принадлежность. Т.е. они сделаны для идентификации определенных видов возбудителей. Использованный тест «МикозоСкрин» определил видовую принадлежность возбудителей кандидоза кожи и мягких тканей, кератомикоза, онихомикоза и эпидермофитии. Тест был наиболее чувствителен к кандидозу и возбудителя кератомикоза. Чувствительность данного теста составляет от 87% до 97%, специфичность от 75% до 93 %.

Само исследование возбудителей грибковых заболеваний с помощью ПЦР теста занимает около 3–4 часов. Часто указываемый срок выполнения 1–2 дня. Время проведения анализа зависит от типа заболеваний.

Исследования грибковых заболеваний кожи мягких тканей было намного дороже. Кроме того, для проведения анализа требуется специальные пакетные программы. В целом методы молекулярного исследования дают точную информацию при диагностике грибковых заболеваний у пациентов, благодаря чему можно точно определить вид возбудителя, поставить точный диагноз и провести соответствующее лечение.

На основе этого метода диагностика и лечение заболевания будут относительно эффективными. В частности, молекулярные методы исследования имеют большое значение в эффективном лечении и обладают высокой экономической эффективностью. Оценка микробиологического (культурального) метода для диагностирования грибковых заболеваний. Для идентифицирования возбудителей грибковых заболеваний нами были использованы готовые питательные среды Сабуро и хромогенные питательные агары. На стандартной питательной среде Сабуро культивировали все образцы, полученные от людей с диагнозом микоза. Для проведения анализа мы сначала подготовили агар.

Так как образцы биоматериалов были готовы, сразу сделали посев и инкубировали при температуре 300C. Через 48-72 часов инкубации проводили учет колоний возбудителей. Результаты приведено в Таблице 4.

Таблица 4

ПЛОТНОСТЬ ПОПУЛЯЦИЙ ГРИБКОВЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ НА АГАРЕ САБУРО

Возбудители	Результаты, КОЭ/мл
Malassezia furfur или Pityrosporum orbiculare	106 - 107
Candida albicans	106 - 107
C. tropicalis	104 – 105
C. parapsilosis	106 - 107
C. glabrata	105 – 106
C. intermedia	106 - 107
С. Dubliniensis	106 - 107
C. guilliermondii	103 – 104
Epidermophyton floccosum	105 – 106
Trichophyton mentagrоphytes var. interdigitale	104 – 105
Trichophyton rubrum	106 - 107
Microsporum ferrugеneum	102 – 103

Как приведено в Таблице 4, в агаре Сабуро исследованные возбудители хорошо росли, особенно кандиды, чтобы получить более достоверный ответ мы продлили инкубацию еще на 24 часа. После дополнительной инкубации во всех чашках Петр росли плотные колонии возбудителей грибковых заболеваний. Здесь можно сказать, что чувствительность агара Сабуро на дрожжеподобные грибы варьируется в пределах 90-98%, а его специфичность 7995%. Кроме того, подтвердить эффективность микробиологического, точнее культурального метода для выявления возбудителей грибковых заболеваний нами были использованы хромогенные агары. В этих хромогенных питательных средах дали хороший рост возбудители кандидоза кожи и мягких тканей. Остальные возбудители не дали рост именно на этих хромогенных средах, так как эти хромогенные агары были предназначены для идентифицирования возбудителей кандидоз.

Во время исследований в разных питательных средах скорость роста колоний разных видов грибов намного отличались. Самый быстрый рост в хромогенной среде отмечается первые 24-48 часов.

В обычных средах от 48 часов до 2-х недель. При определении чувствительности разных методов и выявлении грибковых возбудителей рассмотрели основные преимущества и недостатки. Каждый метод по-своему имеет свои недостатки и преимущества (Таблица 5).

Таблица 5

ОСНОВНЫЕ НЕДОСТАТКИ И ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДОВ ПРИ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГРИБКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Методы	Преимущества	Недостатки
Микроскопический метод	За короткое время можем получит результат	Невозможно определить вид возбудителя.
Молекулярный метод	С первого раза можно определить вид исследуемого возбудителя	Не универсален, предназначен для определенных видов дерматофитов
Микробиологический или культуральный метод	Видовое определение каждого возбудителя	Предназначен для определенных видов.Для проведения анализа требуется намного дольше времени

Заключение

В результате проведенных исследований можно сделать вывод: микроскопический метод при идентификации возбудителей грибковых заболеваний является самым простым и доступным, чувствительность метода – 87-91%, специфичность – 29%. Для полного получения результата требуется 1 день, не требуется особого оборудования. Лаборатория может дать только такой ответ: «Найден» или «Не найден» мицелии гриба или споры гриба. Экономическая эффективность сравнительно низкая, затраты данного метода не дорогие. Самым чувствительным (до 98%), специфичным (до 93%) и экономически эффективным методам является молекулярный метод, за короткий срок можно получить точный результат, но затраты данного метода намного дороже чем в других методах. ПЦР тест предназначен только для определенных видов. При проведения культурального метода получим точный результат, но для проведения требуется намного дольше времени. Чувствительность метода – 90-98%, специфичность – 79-95%, благодаря чему можно определить вид возбудителя грибковых заболеваний, поставить точный диагноз и провести эффективное лечения.