Сравнительное изучение пролиферативной активности (по исследованию антигена Ki-67 и активности ядрышковых организаторов) в эпителиальных опухолях толстой кишки

В настоящее время результаты диагностики дисплазии эпителия в аденоме толстой кишки имеют низкую воспроизводимость, что связано со значительной долей субъективизма диагностического процесса.

Целью исследования явилось изучение экспрессии антигена Ki-67 и количества ядрышковых организаторов как объективных маркеров пролиферативной активности в эпителиальных опухолях толстой кишки.

Исследована 51 аденома ректосигмоидного отдела толстой кишки, полученная после проведения эндоскопической полипэктомии. В тубулярных (26) и тубулярно-ворсинчатых (25) аденомах легкая, умeрeннaя и выраженная дисплазия встречалась соответственно в 14; 8; 4 и 7; 13; 5 случаях. Средний возраст пациентов с аденомой составил 59,2 года (25–75 лет), 24 женщины и 27 мужчин. Также исследованы биопсии 5 высокодифференцированных аденокарцином (средний возраст пациентов 58,2 года, 41–70 лет) и 10 случаев неизмененной слизистой оболочки толстой кишки (средний возраст пациентов 55,5 года, 45–79 лет). Кусочки ткани фиксировали в 10 % нейтральном забуференном фор-мaлине. После стандартной депарафинизации срезы толщиной 2 мкм автоклавировали при 1200С 20 мин в 0,01 М цитратном буфере (рН=6,0). После охлаждения помещали в 2н. муравьиную кислоту нa 12 мин при комнатной температуре. Окрашивали по одностадийной методике (Ploton D. et al., 1986), в течение 16 мин при 370С. В каждом случае подсчитывали количество гранул серебра в 100–120 ядрах эпителиальных клеток, в 10 полях зрения, при увеличении х1000. Иммуногистохимическое определение антигена Ki-67 проводили на срезах толщиной 4 мкм. После стандартной депарафинизации срезы автоклавировали при 1200С 20 мин в 0,01 М цитратном буфере (рН=6,0), после охлаждения помещали в 3 % раствор перекиси водорода (при +40С) на 20 минут. Инкубация с первичными антите-лaми к антигену Ki-67 (клон MIB-1, «Dako») в разведении 1:400 длилась 18–24 ч (при +40С), иммунное окрашивание проводили стрептавидин-биотиновым пероксидазным методом («Dako», LSAB+ Kit, HRP), в качестве хромогена использовали раствор 3,3-диаминобензидина («Dako», Liquid DAB+). B каждом случае исследовали 1000 эпителиальных клеток, в 5–7 полях зрения, при увеличении х400. Определяли индекс метки (ИМ) Ki-67 – количество положительно окрашенных ядер клеток от общего количества подсчитанных клеток, в процентах. Статистический анализ полученных данных осуществляли в пpoгpaммe STATISTICA 6.0, данные представляли в виде медианы и интерквартильного интервала, использовали непараметрические методы: U-тест Манна–Уитни и коэффициент корреляции Спирмeнa (r).

B нижних 2/3 крипт слизистой оболочки (пролиферативный компартмент) количество грaнул серебра в ядрах клеток составило 5,3 (4,9–5,5), ИМ Ki-67 – 32,4 % (29,4– 34,3 %). B очагах легкой, умеренной и выраженной дисплазии содержание грaнул серебра равнялось 6,5 (6,1–7,0), 10,4 (9,7–11,1) и 16,6 (15,0–17,6) соответственно, a в высокодифференцированной аденокарциноме – 21,1 (20,1–21,9).

ИМ Ki-67 в очагах легкой, умеренной и выраженной дисплазии составил соответственно 10,6 % (7,3–25,2%), 25,3 % (22,0–28,8%) и 34,8 % (32,7–38,0 %), в высокодифференцированной аденокарциноме – 42,2 % (41,0–44,6 %).

Определены статистически значимые отличия количества гранул серебра в ядрах клеток между пролиферативным компартментом крипт и легкой дисплазией (р=0,001), а также легкой и умеренной дисплазией (р<0,001); умеренной и выраженной дисплазией (р<0,001); выраженной дисплазией и высокодифференцированной аденокарциномой (р=0,009). B ряду легкая – умеренная – выраженная дисплазия –высокодифференцированная аденокарцинома происходило статистически значимое увеличение ИМ Ki-67 (р<0,001). По сравнению с пролиферативным компартмен-том слизистой оболочки ИМ Ki-67 оказался ниже в очагах легкой и умеренной дисплазии (р<0,001), в очагах выраженной дисплазии не отличался в тубулярной аденоме

(р=0,40) и выше в тубулярно-ворсинчатой (р=0,04). Bы-раженность дисплазии эпителия аденомы имела статистически значимую корреляцию с ИМ Ki-67 (r=0,78; р<0,001) и количеством гранул серебра в ядрах клеток (r=0,92; р<0,001). Результаты исследования ИМ Ki-67 и количества гранул серебра в ядрах клеток имели статистически значимую корреляцию (r=0,71; р<0,001). B ряду легкая – умеренная – выраженная дисплазия – высокодифференцированная аденокарцинома увеличивается количество Ki-67-положительных клеток и ядрышковых организаторов в ядрах клеток. Активность ядрышковых организаторов коррелирует с экспрессией антигена Ki-67. Количественный подсчет Ki-67-положительных клеток и ядрышковых организаторов может служить дополнительным, объективным критерием при дифференциальной диагностике дисплазии в аденоме и рака толстой кишки.