Сравнительное изучение противоопухолевой активности липосомальных лекарственных форм препаратов производных нитрозоалкилмочевины

Лизомустин - 2-хлорэтилнитрозоуреидопроиз-водное аминокислоты лизин - относится к группе нитрозоалкилмочевин (НАМ) и представляет собой смесь двух изомеров (активного и малоактивного). Препарат синтезирован в Институте органического синтеза Уральского отделения РАН, лиофилизированная лекарственная форма для внутривенного введения разработана в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Клиническое изучение лизомустина показало эффективность препарата при мелкоклеточном раке легкого и меланоме кожи [1 ].

БХНМ -1,3 -бис(2-хлорэтил)-1 - нитрозомочевина — воспроизведенная субстанция Кармустина (BiCNU). Препарат синтезирован в лаборатории антиметаболитов Института химии Уральского отделения РАН. В ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина разработана лекарственная форма данного препарата. Препарат относится к классу НАМ. В экспериментальных исследованиях высоко эффективен при опухолях мозга [3].

С целью увеличения селективности и пролонгирования противоопухолевого эффекта лизому-стина и БХНМ нами предпринята попытка создания новой лекарственной формы препарата в виде липосом. Липосомы - липидные везикулы, обладающие рядом достоинств. Благодаря своим коллоидным свойствам, контролируемым размерам, поверхнос- тным характеристикам, мембранотропности и биосовместимости липосомы рассматриваются как перспективные системы доставки препаратов в кровеносное русло. Универсальность свойств липосомального носителя обеспечивает широкие возможности его применения, особенно в химиотерапии рака, так как липосомы позволяют предотвратить быструю деградацию высокореактивных противоопухолевых препаратов в биологических субстратах организма [2].

Наряду с разработкой обычных липосом ("conventional"), в последние годы внимание ученых привлекают различные способы модификации поверхности липидных везикул с целью замедления захвата их клетками ретикулоэндотелиальной системы и пролонгирования времени циркуляции в кровотоке [4]. Известен способ видоизменения липосомальной поверхности полимерами с гибкой гидрофильной цепью. Для этого использовали синтетические липиды, коньюгированные с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Включенные в липидный бислой молекулы ПЭГ способны создавать на мембране избыточное осмотическое давление, защищая тем самым липосомальные везикулы от опсонинов. Подобное покрытие позволяет липосомам дольше находиться в кровотоке, что повышает их противоопухолевую активность [5].

Цель настоящего исследования—изучить противоопухолевую активность лшюсомальных лекарственных форм Лизомустина и Бис(хлорэтил)нитро-зомочевины в зависимости от их состава.

Материалы и методы

Лизомустин-ФСП 42-0494-4519-03, ООО«АКА-ДЕМФАРМ».

Лизомустин лиофилизат для приготовления раствора для инъекций - ФСП 42-0105-0867-01, ООО ФИРМА «ГЛЕС».

БХНМ - 1,3-бис(2-хлорэтил)-1- нитрозомочевина - воспроизведенная субстанция Кармустина (BiCNU).

При проведении исследований использованы вспомогательные вещества, которые отвечали требованиям соответствующей нормативной документации: ГФ XI изданий, USP 24 NF 19, отдельных фармакопейных статей и ГОСТов.

• 1.    Лецитин (Фосфотидилхолин) - Е-80 «Lipoid» (Германия).

• 2.    Холестерин - «Lipoid» (Германия).

• 3.    Кардиолипин - «Lipoid» (Германия).

• 4.    Фосфотидилэтаноламинполиэтиленгликоль -2000 «Lipoid» (Германия).

• 5.    Дистеароилфосфотидилэтаноламинполиэти-ленгликоль — 5000 — «Avanti Polar Lipids» (США).

• 6.    Спирт этиловый 95 % - ФС 42-3072-00.

• 7.    Антиоксидант- а-токоферол USP-NF (24).

• 8.    Раствор глюкозы 5 % для инъекций.

• 9.    Вода дистиллированная для инъекций, ФС 42-2620-98.

Упаковочный материал

Для упаковки липосомальных дисперсий использовали флаконы из дрота (стекло НС-1) вместимостью 20 мл (ТУ 64-2-10-87), которые укупоривали си-ликонированными резиновыми пробками по ИСО 8362-2 под обкатку алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-009-86.

Приборы и аппаратура

В работе использовали вакуумный насос ВН-464А, испаритель ротационный ИР-1М, оборудование фирм «Миллипор» и «Nuclepore», прибор «На-носайзер» (Submicron Particle Sizer Nicomp 380, измеряющий размер наночастиц, США), мини-экструдер («Avanti Mini-Extruder» set № 610000, США).

• 1.    Технологический метод получения пегилированных липосом Лизомустина

  Малые однослойные пегилированные липосомы лизомустина получали гидратацией липидной пленки, образующейся после упаривания в вакууме спиртовых растворов липидов, 1% водным раствором субстанции лизомустина с последующей экструзией лшюсомальной дисперсии через поликарбонат-ные мембраны с уменьшающимся диаметром пор (1,2 мкм; 0,4 мкм; 0,2 мкм). В качестве липидной основы использовали лецитин (фосфотидилхолин), для стабилизации липидного бислоя и уменьшения "вытекания" включенного в липосомы препарата в липидную оболочку вводили холестерин и кардиолипин. Антиоксидант а-токоферол использовали для предотвращения перекисного окисления липидов. Для создания липосом с пролонгированным временем циркуляции в кровяном русле в составы липидных оболочек включали PEG 5000 DSPE и PEG 2000 РЕ.

• 2.    Технологический метод получения пегилированных липосом БХНМ

  Малые однослойные пегилированные липосомы БХНМ получали методом "обращения фаз". Субстанцию БХНМ вносили в хлороформную смесь липидов непосредственно перед первым вакуумным упариванием. Для создания липосом с пролонгированным временем циркуляции в кровяном русле в модельные смеси липидов включали PEG 5000 DSPE или PEG 2000 РЕ. Затем лшшдную пленку с дисперсией многослойных липосом БХНМ смывали эфиром и проводили повторное упаривание эфирной смеси под вакуумом. После водной регидратации липидной пленки липосомальную дисперсию пропускали через гомогенизатор, продавливая через поликар-бонатные мембраны с уменьшающимся диаметром пор (1,2 мкм; 0,4 мкм; 0,2 мкм).

• 3.    Определение размера липосом

• 4.    Биологический метод

  Определение противоопухолевой активности новых липосомальных лекарственных форм Лизомус-тина и БХНМ проводили на экспериментальной модели опухоли мышей - лейкозе L-1210, мышах-гибридах BDF1, самцах.

Размер липосом определяли на спектрометре Nano-Sizer. Принцип работы прибора: определяется отраженный свет (под фиксированным углом) от совокупности частиц, суспендированных в водном растворителе. Интенсивность этого света колеблется во времени благодаря диффузии частиц. Существует четко определяемое характеристическое время жизни этих колебаний, которое обратно пропорционально диффузивности частиц. Далее просчитывается автокорреляционная функция флуктуирующей интенсивности и строится убывающая экспоненциальная кривая (зависимость от времени). После получения константы времени затухания г, рассчитывается диффузивность частиц. Наконец, с помощью уравнения Стокса-Энштейна рассчитывается радиус частиц:

гдг К-кижтическаяюнстангаБольцмана(138х Ю^едк"1),

Т-температура (к = С°+273),

П t] -вязкость раствора (1,002 10²для воды при20°С).

Все математические операции проводили на компьютере с помощью специальной программы. На экране автокорреляционного спектрометра наблюдали кривую распределения липосом по размерам частиц. Результат оценивали с помощью гауссовского анализа (обработка полученных данных методом наименьших квадратов - анализ по двум параметрам). Гауссовы популяции имели четко определяемый средний диаметр частиц. Однако этот подход используют только для простых распределений: симметричных унимодальных популяций. Аси-метричные унимодальные и бимодальные распределения невозможно интерпретировать с помощью гауссовского анализа. Единственным признаком наличия более сложного распределения является высокое и растущее значение квадратичного отклонения (А!2). Эти распределения оценивают с помощью никомповского анализа. Nicomp-анализ дает в результате 3 или 4 параметра, по которым можно судить о распределении липосом в образце (в %).

Лейкоз прививали внутрибрюшинно по 1,01,2 х 106 клеток/мышь в 0,3 мл среды 199. Лечение начинали через 48 ч после трансплантации опухоли. Препараты вводили внутрибрюшинно, однократно. Лизомустин в липосомальной лекарственной форме с PEG 5000 (состав 1) и с PEG 2000 (состав 2) (концентрация 10 мг/мл) вводили животным в дозах 100, 125,150,175,200,225 и 250 мг/кг. БХНМ в липосомальной лекарственной форме с PEG 5000 (состав 1) и с PEG 2000 (состав 2) (концентрация 2 мг/мл) - в дозахЗО, 35,40,45 и 50 мг/кг.

Терапевтический эффект оценивали по двум критериям: увеличению продолжительности жизни леченых животных (УПЖ, %) и излечению животных.

• 1.    УПЖ вычисляли по формуле:

• 2.    Излечение животных: n/п,, где п/п,- число излеченных мышей к общему числу животных в группе. Излеченными считали животных, не имею щих рецидивов заболевания после окончания лече ния в течение 2 мес и более.

СПЖо-СПЖк

УПЖ=------------------------хЮ0%,

СПЖк где СПЖ0 и СПЖк - продолжительность жизни испытуемых мышей в опытных и контрольных группах, соответственно.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по критериям Стьюдента (параметрический) и Колмогорова - Смирнова (непараметрический).

Результаты и обсуждение

Как видно из табл. 1, лизомустин в ЛЛФ-5000 в

Получено два состава липосом с различными ПЭГ липидами. В результате разработки липосомальных лекарственных форм состава-1 Лизомустина и БХНМ в липидную мембрану включили PEG 5000 В8РЕ(ЛЛФ-5000),авсссгав-2-РШ2000РЕ(ЛЛФ-20(Ю).

Лизомустин - водорастворимый препарат, это позволило включить его во внутреннее водное пространство липосом. БХНМ хорошо растворим в органических растворителях, и поэтому был включен в липидный бислой.

В результате проведенных технологических исследований установлено оптимальное молярное соотношение компонентов, включенных в модельные составы липосомального лизомустина и БХНМ.

Состяв-1 (ЛЛФ-5000) для лизомустина:           для БХНМ:

Лизомустин                БХНМ

Лецитин                   Лецитин

Холестерин                  Холестерин

Кардиолипин               Кардиолипин

Диете ароилфосфотидилэтаноламин

Дистеароилфосфотидилэтаноламин полиэтиленгликоль 5000 полиэтиленгликоль 5000

а-токоферол

а-токоферол

Состав-2

для лизомустина: Лизомустин

Лецитин

Холестерин Кардиолипин Кардиолипин Фосфотидилэтаноламин полиэтиленгликоль 2000 а-токоферол

(ЛЛФ-2000)

для БХНМ:

БХНМ

Лецитин

Холестерин

Фосфотидилэтаноламин полиэтиленгликоль 2000

а-токоферол

Первичную стандартизацию липосомалышх дисперсий проводили по следующим критериям качества: внешний вид, размер липидных везикул и противоопухолевая активность. Дисперсии липосом ли-зомустина и БХНМ по внешнему виду не различались - молочно-белые эмульсии, однородные, без расслоения.

При введении лизомустина в ЛЛФ-5000 сразу получены мелкие липосомы — 155 ±23 нм, поэтому в дальнейшем данные липосомы не измельчали экструзионным методом. Для ЛЛФ-2000 лизомустина первоначальный размер липосом составил 980 ± 34 нм, после экструзии —105 ± 30 нм. Размер липосом для БХНМ в ЛЛФ-5000 - 240 ± 28 нм, данные липосомы дополнительно не измельчали. Для БХНМ в ЛЛФ-2000 первоначальный размер составил 1535 ± 30 нм, после гомогенизации -140 ± 21 нм, соответственно.

В табл. 1 представлены результаты изучения противоопухолевой активности ПЭГ липосом лизомус-

Таблица I

Противоопухолевая активность липосомального лизомустииа на лейкозе L-1210

Группа опыта	Доза, мг/кг, в/б х 1 раз	УПЖ,% животных, погибших от лейкоза	Излечение ЖИВОТНЫХ, П/П|. (%)
ЛЛФ-5000	100	357(1/5)	4/5(80)
липосомальная	125	—-	6/6(100)
лекарственная	150	—	5/5(100)
форма	175	—	5/5(100)
литомусгина	200	—	5/5(100)
	225	—	5/5(100)
	250	—	5/5(100)
ЛЛФ-2000	100	178,5(2/5)	3/5(60)
липосомальная	125	385,5(2/5)	3/5(60)
лекарственная	150	386(1/5)	4/5(80)
форма	175	*	5/5(100)
лизомустина	200*	—	4/5(80)
	225*	614(1/5)	3/5(60)
	250* *	-	3/5(60)

Примечание: Контроль 1 - нелеченые мыши, средняя продолжительность жизни мышей 7,3 дня; контроль 2 - мышам вводили пустые липосомы, средняя продолжительность жизни 7 дней.

• В данных группах 20 % мышей пали от токсичности.

♦* В данной группе 40 % мышей пали от токсичности.

Данные статистически достоверны, р<0,05 по отношению к контролю.

дозах от 125 до 250 мг/кг на мышах с лейкозом L-1210 проявил самый высокий терапевтический эффект. В указанных дозах излечение мышей составило 100 %. Гибели животных от токсичности не выявлено. Ли-зомустин в ЛЛФ-2000 излечивал 100 % животных с лейкозом только в дозе 175 мг/кг. В дозах 100; 125 и 150 мг/кг излечение животных составляло 60, 60 и 80 %, соответственно. Дозы 200 и 225 мг/кг — токсичны для 20 %, доза 250 мг/кг - для 40 % мышей.

Данные табл. 2 показывают, что БХНМ в ЛЛФ-5000 и ЛЛФ-2000, примененный в дозах 30-35 мг/кг, проявлял смешанный эффект, выраженный как увеличением продолжительности жизни, так и излечением части животных. БХНМ в ЛЛФ-5000 в дозах 40 и 45 мг/кг проявил максимальный терапевтический эффект, при этом излечение животных составило 100 %. Доза 50 мг/кг оказалась летальной для 100 % мышей. При применении БХНМ в ЛЛФ-2000 форме 100% излечения не выявлено. Частичное излечение животных (17 %) наблюдали в дозах 40-45 мг/кг, в дозе 50 мг/кг излечение животных увеличивалось до 33 %, однако оно сопровождалось гибелью 17 % мышей от токсичности.

Таблица 2

Противоопухолевая активность липосомального БХНМ на лейкозе L-1210

Группа опыта	Доза, мг/кг, В/6Х1 раз	УПЖ.% животных, погибших от лейкоза	Излечение животных, п/П! (%)
ЛЛФ-5000	30	160(6/6)	—
липосомальная	35	111(3/5)	2/5(40)
лекарственная	40	—	6/6(100)
форма БХНМ	45	—	5/5(100)
	50»	—.	—
ЛЛФ-2000	30	104,9(5/6)	1/6(17)
липосомальная	35	123,3(6/6)	—
лекарственная	40	144(5/6)	1/6(17)
форма БХНМ	45	166(5/6)	1/6(17)
	50**	124(3/6)	2/6(33)

Примечание: контроль 1 - нелеченые мыши, средняя продолжительность жизни мышей 8,6 дня; контроль 2 - мышам вводили пустые липосомы, средняя продолжительность жизни 8,2 дня

• •В данной группе 100 % мышей погибли от токсичности.

• ** В данной группе 17 % мышей погибли от токсичности.

Данные статистически достоверны, р < 0,05 по отношению к контролю.

Таким образом, проведенные исследования показали, что лизомустин и БХНМ в новой ЛЛФ-5000 оказались наиболее эффективными. Лизомустин, примененный в ЛЛФ-5000, позволяет расширить диапазон доз от 125 до 250 мг/кг, излечивающих 100 % животных без проявления токсичности. Как показали ранее проведенные исследования, лизомустин в лиофилизированной лекарственной форме излечивал 100%животныхслейкозомЬ-1210тольковдозах 150 и 175 мг/кг. БХНМ в ЛЛФ-5000 показала большую эффективность по сравнению с ЛЛФ-2000 БХНМ (100 % излечение в дозах 40-45 мг/кг).

Выводы

• 1.    Разработаны новые лекарственные формы Ли-зомустина и БХНМ в виде пегилированных липосом.

• 2.    Показан высокий противоопухолевый эффект лизомустина в ЛЛФ-5000 липосомах во всех тести руемых дозах (125-250 мг/кг).

• 3.    Лизомустин в ЛЛФ-5000 является более эф фективной лекарственной формой, чем ЛЛФ-2000, и позволяет расширить диапазон терапевтических доз и снизить токсичность препарата.

• 4.    БХНМ в ЛЛФ-5000 вызвала 100% излечение животных от лейкоза L-1210 в дозах 40 и 45 мг/кг.