Сравнительное изучение ультраструктуры сперматозоидов в эпидидимальной, эякулированной и криоконсервированной сперме жеребцов

Искусственное осеменение кобыл свежеразбавленной, охлажденной и криоконсервированной спермой позволяет наиболее широко использовать генетический потенциал жеребцов (1). Метод криоконсервации спермы и технологии повышения репродуктивного статуса жеребцов-производителей важны при сохранении генетического разнообразия и селекционной работе в коневодстве. Преимущества криоконсервации очевидны: ее применение позволяет создавать банки спермы высокоценных производителей, в течение долгого времени сохранять генетический материал для селекции, транспортировать сперму на большие расстояния (2).

Для криоконсервации эякулированной спермы жеребцов разрабо-

^∗ Исследования проводились при поддержке Российского научного фонда (проект ¹ 17-16-01109).

таны и успешно применяются различные технологии (3-5). Тем не менее, получение и криоконсервация спермы жеребцов-производителей включает ряд критических этапов, на которых качество спермы снижается (6). К ним можно отнести процедуру взятия, разбавление, температурный шок при замораживании и оттаивании. В ряде случаев объективно возникает необходимость в криоконсервации эпидидимального семени, например при гибели высокоценных жеребцов или травмах с неблагоприятным прогнозом к выздоровлению (7-9). Для некоторых уникальных аборигенных пород с табунно-тебен¸вочным содержанием использование эпидидимального семени — единственное экономически оправданное мероприятие при формировании криобанков.

Главная проблема при криоконсервации спермы — ее качество после оттаивания (10). В основном оно ухудшается вследствие уменьшения количества активных сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением, снижения выживаемости спермиев и их структурных нарушений. Морфология сперматозоидов, наряду с подвижностью и выживаемостью, относится к важнейшим показателям качества спермы (11). Увеличение доли аномальных половых клеток в эякуляте в разной степени связано с меньшей плодовитостью жеребцов (12-14). Вследствие ряда биологических особенностей таких сперматозоидов их оплодотворяющая способность снижена (15). Обычно сперму изучают с помощью световой микроскопии, что не позволяет выявить значительную часть ультраструктур-ных повреждений в сперматозоидах. При низкой фертильности жеребцов рекомендуется проводить дополнительные исследования спермы (16), в частности электронную микроскопию (17). На сегодняшний день это наиболее точный метод ультраструктурного анализа (18), применяемый для определения этиопатогенеза патозооспермии, функционального состояния сперматозоидов и диагностики нарушений в половых клетках вследствие криоконсервации.

Сперматозоиды из семявыносящих канальцев поступают в эпидидимис, где происходит их окончательное созревание и приобретается способность к оплодотворению (19-22). В придатках семенников в общей сложности содержатся от 15 до 25 млрд сперматозоидов (23, 24). Поэтому извлечение сперматозоидов из эпидидимиса позволяет получать достаточное количество половых клеток для искусственного осеменения как све-жеразбавленной, так и охлажденной и криоконсервированной спермой.

Подвижность, морфологию, целостность ДНК, жизнеспособность сперматозоидов в эякулированной и эпидидимальной сперме исследовали многие авторы (7, 24-26). Примененные нами впервые методические подходы позволили провести сравнительный анализ ультраструктуры половых клеток (при разных способах получения и после криоконсервации) на биологическом материале от одних и тех же жеребцов, что исключало влияние индивидуальных особенностей разных особей на сопоставляемый признак. Это дает новые знания о состоянии и сохранности органоидов при замораживании-оттаивании эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов.

Целью настоящей работы было сравнение ультраструктуры сперматозоидов из эпидидимиса и эякулята, подвергнутых криоконсервации, и диагностика основных патологий органоидов.

Методика. Эякулированную сперму получали с интервалом 48 ч с помощью искусственной вагины у 5 жеребцов разных пород в возрасте от 5 до 8 лет (показатели спермы первых двух эякулятов после периода полового покоя при обработке данных не учитывали). Эякуляты оценивали по объему, содержанию, подвижности, морфологии (27), выживаемости сперматозоидов при температуре 2-4 °С, по времени сохранения их подвижности (3). При разбавлении спермы использовали лактозо-хелато-цитратно-желточную (ЛХЦЖ) среду в объемном соотношении 1:3 (3). Сперму замораживали в парах жидкого азота по стандартной технологии Всероссийского НИИ коневодства и хранили в жидком азоте при температуре -196 °С. После отбора эякулированного семени жеребцов кастрировали для получения эпидидимальной спермы, которую разбавляли и замораживали по той же технологии.

Для проведения электронной микроскопии нативные и криокон-сервированные образцы эякулированной и эпидидимальной спермы разводили изотоническим раствором NaCl в соотношении 1:10, добавляли фиксатор — 2,5 % раствор глутарового альдегида («Ted Pella Inc.», США), приготовленный на 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,2) («Sigma», США), центрифугировали 15 мин при 1000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, осадок фиксировали тем же фиксатором, дофиксировали 1 % раствором осмиевой кислоты («Serva», Германия) и заливали в эпон («Fluka», Германия). Ультратонкие срезы получали на микротоме UltraCut III («Reichert Jung Optische Werke AG», Австрия), докрашивали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца («Serva», Германия) и просматривали в электронном микроскопе Hitachi 700 (Япония). Общий вид сперматозоидов изучали при увеличении ½5000, акросомы, хроматин ядра и митохондрии — при ½16000-18000, аномалии аксонемы на поперечных срезах жгутиков — при ½20000-25000. В каждом образце анализировали не менее 150 половых клеток.

Данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. В таблице представлены средние ( Х ) и стандартные ошибки средних ( х ). Достоверность различий определяли с помощью t -критерия Стьюдента. Статистически значимыми считались различия при p < 0,05.

Результаты . В полученных эякулятах объем в среднем составил 54,8±8,8 мл, содержание сперматозоидов — 184,5±23,7 млн/мл, активность — 4,4±0,3 балла, выживаемость при температуре 2-4 ° С — 125,2±8,4 ч; после криоконсервации активность снизилась до 1,8±0,2 балла, выживаемость — до 59,2±14,7 ч. Доля морфологически нормальных сперматозоидов в нативной сперме достигала 71,4±4,4 %, в криоконсервированной — 68,4±4,0 %.

Доля (%) сперматозоидов с нормальной морфологией в свежеполученной и криокон-сервированной эякулированной и эпидидимальной сперме жеребцов ( n = 5, Х ± х )

Морфологический признак	Эпидидимальная сперма		Эякулированная сперма
	при получении	после оттаи вания	при получении	после оттаи вания
Интактная головка	76,1±4,2	64,4±6,1	73,6±4,2	57,2±7,3
Присутствие акросомы	98,5±0,5	92,6±1,3	98,0±0,7	89,1±1,9
Нормальное положение акросомы	99,2±0,8	98,2±1,6	98,4±0,7	91,8±3,7
Нормальная форма акросомы	94,4±1,6	87,8±2,9	91,6±1,5	87,0±2,9
Компактное содержимое акросомы	87,6±3,3	73,5±5,2	86,0±3,7	72,6±6,7
Нормальная форма ядра	99,6±0,2	97,3±1,2	98,3±1,3	93,7±3,3
Нормальные митохондрии	97,1±1,3	90,3±1,4	93,7±2,3	88,0±2,1
Нормальные аксонемы	91,5±2,3	84,7±4,5	88,3±2,9	84,8±4,1
Нормальные наружные плотные фибриллы	99,5±0,5	98,9±1,1	98,8±1,2	98,7±1,3
Нормальная фиброзная оболочка	100	99,0±1,1	100	98,0±2,0

Использование эякулированной и эпидидимальной спермы от одних и тех же жеребцов позволило сравнить повреждения половых клеток после криоконсервации в зависимости от способа отбора образцов. Один из основных показателей качества спермы, определяемых с помощью 276

электронной микроскопии, — количество сперматозоидов с интактными головками (рис. 1), имеющими нормальные акросомы, форму и хроматин ядра (18). В эпидидимальной сперме доля таких сперматозоидов составила 76,1 %, после эякуляции — снижалась на 2,5 % (табл.). При замораживании-оттаивании эякулированной спермы число сперматозоидов с интактными головками уменьшалось еще на 16,4 % и составило в среднем 57,2 %. В криоконсервированной эпидидимальной сперме количество сперматозоидов с интактными головками (64,4 %) было на 7,2 % выше, чем в замороженной эякулированной.

Рис. 1. Нормальный сперматозоид жеребца (слева) и сперматозоид с ассиметричной цитоплазматической каплей (справа) : 1 — акросома, 2 — хроматин, 3 — продольный срез через аксо-нему жгутика, 5 — цитоплазматическая капля. Электронный микроскоп Hitachi 700 (Япония), увеличение ½5000-25000.

Из патологий головок сперматозоидов при получении и криоконсервации спермы отмечали увеличение числа сперматозоидов с деградацией акросомы в результате преждевременной акросомной реакции, с гипоплазией акросомы (некомпактное содержимое акросомы), изменениями формы ядра, вакуолизацией хроматина.

В основном при криоконсервации как эякулированной, так и эпидидимальной спермы жеребцов повреждалась акросома (рис. 2, 3). В эпидидимальной сперме она присутствовала у 98,5 % сперматозоидов, в эякуляте и после замораживания-оттаивания доля сперматозоидов с прореагировавшей акросомой (с деградацией акросомы) возрастала на 9,4 %. При замораживании и последующем оттаивании количество сперматозоидов с деградацией акросомы в эпидидимальной сперме увеличивалось на 5,9 % (p < 0,05), в эякулированной — на 8,9 % (p < 0,01).

Рис. 2. Сперматозоид жеребца с «пустой» акросомой (слева) и сперматозоид с прореагировавшей акросомой (после прошедшей акросомной реакции) (справа) : 1 — акросома с электронно-прозрачным содержимым («пустая») и неровными контурами, 2 — остаточный материал прореагировавшей акросомы. Электронный микроскоп Hitachi 700 (Япония), увеличение ½16000-18000.

К наиболее распространенным патологиям при криоконсервации также относилось увеличение числа сперматозоидов с гипоплазией акро- сом и отсутствием содержимого (акросомы с электронно-прозрачным содержимым). В криоконсервированном эякуляте доля сперматозоидов с некомпактным содержимым акросомы возрастала на 13,4 %, после замораживания и оттаивания эпидидимальной спермы — на 14,1 %.

Рис. 3. Начальная стадия повреждения акросомы сперматозоида жеребца: 1 — зоны диффузного расширения акросомы с волокнистым содержимым, 2 — участок расширенной акро-сомы с электронно-прозрачным содержимым («пустая» ак-росома), 3 — участок расширенной акросомы с волокнистым содержимым. Электронный микроскоп Hitachi 700 (Япония), увеличение ½16000-18000.

Воздействие криоконсервации на ядро сперматозоидов было минимальным: изменения формы ядра отмечали при получении и криоконсервации спермы в среднем всего у 5,9 % клеток. В свежеполучен-ной сперме сперматозоиды с вакуолизированным хроматином ядра не встречались, после криоконсервации их выявили в небольшом количестве (от 1,6 до 6,1 %) в образцах от двух жеребцов.

В эпидидимальной сперме доля сперматозоидов с нормальными митохондриями составила 97,1 %, в эякуляте — 93,7 %. Таким образом, при получении спермы и ее первичной обработке число спер- матозоидов с поврежденными митохондриями увеличилось на 3,4 %, при криоконсервации — еще на 5,7 %, в результате митохондрии оказались повреждены у 9,1 % сперматозоидов. По росту числа аномалий митохон- дрий при криоконсервации эпидидимальной спермы по сравнению со све-жеполученной достоверность различий была достаточно высока (p < 0,05).

Морфологические аномалии аксонемы тесно взаимосвязаны с низкой фертильностью и бесплодием (27). Поэтому исследование целостности аксонем — один из обязательных этапов при электронно-микроскопическом исследовании эякулята. Аксонема как у эпидидимальных, так и у эякулированных сперматозоидов оказалась весьма устойчива к криоконсервации. От получения спермы до ее замораживания и последующего оттаивания число сперматозоидов с анормальной формой жгутика увеличивается на 6,7 %, что существенно ниже аналогичного показателя для повреждений митохондрий и особенно акросомы.

Наружные плотные фибриллы и фиброзная оболочка аксонемы сперматозоидов жеребцов тоже устойчивы к внешним воздействиям: как было показано, они практически не повреждаются ни при получении спермы, ни при замораживании-оттаивании.

В целом, результаты диагностики ультраструктурных аномалий в эпидидимальных и эякулированных спермиях продемонстрировали, что при получении спермы на искусственную вагину повреждения органоидов половых клеток минимальны, а основные структурные изменения происходят при криоконсервации. Подтверждение высокой сохранности эпиди- димальных сперматозоидов, а также их устойчивости к криоконсервации позволяет сделать позитивный прогноз по разработке и применению технологии криоконсервации эпидидимальной спермы жеребцов.

Итак, ультраструктурная целостность органоидов в половых клетках жеребцов в эпидидимальной сперме выше, чем в эякулированной, однако эти различия недостоверны. В меньшей степени ультраструктурные повреждения сперматозоидов происходят при получении спермы, в большей — в процессе ее криоконсервации. При замораживании и оттаивании как эпидидимальной, так и эякулированной спермы наиболее уязвима акросома сперматозоидов, менее чувствительны митохондрии, тогда как аксонема, наружные плотные фибриллы и фиброзная оболочка аксонемы достаточно устойчивы, а воздействие на ядро сперматозоидов минимально.