Сравнительные аспекты изменений ультраструктурных островковых поджелудочных островков в экспериментальном сахарном диабете

Одним из приоритетных направлений современной фармакологии является поиск новых лекарственных средств с селективным цитопротективным действием на в-эндокриноциты поджелудочной железы, которые обладают способностью регулировать процессы апоптоза. Достаточно хорошо изучены тканевые и клеточные изменения в панкреатических островках экспериментальных животных, возникающие на фоне экспериментального сахарного диабета при введении различных цитотоксинов [2]. Однако особенности ультраструктурных изменений инсулоцитов островков Лангерганса при их повреждении в сравнительном аспекте изучены недостаточно.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 40 крысах-самцах, массой 300-340 грамм (интактная контрольная группа (n = 10), группы с экспериментальным сахарным диабетом: алоксан-индуцированным (n = 10), стрептозотоцин-индуцированным (n = 10), иммунозависимым (n = 10). Аллоксан-индуцирован-ный диабет вызывали внутрибрюшинным введением аллоксана в дозе 120 мг/кг. Экспериментальный стрептозотоцин-индуцированный диабет моделировали однократным внутривенным введением стреп- тозотоцина в дозе 45 мг/кг (Баранов А. Г., 1985). С целью моделирования иммунозависимого сахарного диабета производили ежедневные в/в инъекции стрептозотоцина (Sigma, США) в дозе 20 мг/кг в течение 5 суток. Через 7 суток осуществляли однократную подкожную инъекцию 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда (США). [15]. У животных экспериментальных групп с моделями диабета после введения цитотоксинов определяли уровень гликемии. В последующий эксперимент производился отбор животных с уровнем сахара крови не ниже 15 ммоль/л (Akbarzadeh A., et al., 2007). Через 21 сутки животных выводили из эксперимента согласно правилам гуманного отношения и решением Регионального независимого этического комитета (№ 43-2006).

Электронно-микроскопическое исследование проводили на базе лаборатории морфологии и иммуногистохимии Волгоградского медицинского научного центра. Фиксацию фрагментов поджелудочной железы размером 1 мм3 производили в течение 12 часов в 4%-м растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1%-м растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (рН = 7,4) при темпе- ратуре +4 оС. После промывки в растворе какодилатного буфера материал дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Изготавливали полутонкие срезы с последующей окраской метиленовым синим. Уль-тратонкие срезы толщиной 50—90 нм получали на ультрамикротоме LKB-8800 и монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5%-м растворе уранилацетата на 50 о этаноле в течение 40 минут и 0,3%-м растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ с фотодокументированием результатов.

Морфометрический анализ ультраструктурных изменений проводили с помощью компьютерной программы «ВидеоТестМорфо-4» (Россия, 2004). Определяли объёмную долю (%) и диаметр (нм) секреторных гранул инсулоцитов. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы «ВидеоТестМорфо-4». Проводили расчет базовых статистических показателей ( M , m), с использованием парного t -критерия Стьюдента при достоверности р < 0,05 [1].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В панкреатических островках интактных животных преобладали инсулоциты пирамидальной формы, которые располагались преимущественно в центральных отделах островков. Центрально расположенное ядро имело овальную форму, четко различимую ядерную оболочку с равномерным распределением хроматина. Ядрышки визуализировались не во всех в-эндокриноцитах. В цитоплазме определялись немногочисленные митохондрии овальной формы и секреторные гранулы с характерной электроноплотной сердцевиной округлой формы, которая отделялась от поверхности окружающей мембраны светлым аморфным ободком.

Часть инсулоцитов имели цитоплазму низкой, а другие умеренной электронной плотности. В в-эн-докриноцитах с цитоплазмой низкой электронной плотности отмечалось хорошее развитие гранулярной эндоплазматической сети в виде большого количества укороченных цистерн, комплекс Гольджи был представлен хорошо различимыми эндосекре-торными гранулами умеренной электронной плотности с аморфным содержимым (без электронно плотной сердцевины), уплощенными цистернами и вакуолями, отмечалось равномерное расположение свободных рибосом и митохондрий. Секреторные гранулы занимали объемную долю — 14 %, а их диаметр колебался в пределах [383,4 ± 43,3] нм.

Гранулярная эндоплазматическая сеть была менее различима в инсулоцитах с цитоплазмой умеренной электронной плотности. Комплекс Гольджи был представлен уплощенными цистернами и небольшим количеством эндосекреторных гранул умеренной электронной плотности без электронно плот- ной сердцевины. Диаметр секреторных гранул в-эндокриноцитов составлял — [412,1 ± 47,4] нм., а их объемная доля — 12 %.

При аллоксан-индуцированном диабете в панкреатических островках определялись единичные в-клетки с признаками деструкции в виде конденсации хроматина ядер, наличия липидных включений в цитоплазме, с расширением и вакуолизацией компонентов гранулярной эндоплазматической сети и комплекса Гольджи и отсутствием секреторных гранул. В большинстве клеток прослеживались набухание и частичная деструкция комплекса Гольджи и элементов эндоплазматической сети. Клеточная популяции инсулоцитов была неоднородной и подразделялась на клетки с цитоплазмой низкой и умеренной электронной плотности. В-клетки с цитоплазмой умеренной электронной плотности располагались как в центральных, так и в периферических отделах островков Лангерганса. Секреторные гранулы с электронно плотной сердцевиной располагались преимущественно у одного из полюсов клетки и занимали объемную долю в 12,2 %, их диаметр составлял [409,3 ± 32,8] нм. Большинство в-эндокриноцитов панкреатических островков имели цитоплазму низкой электронной плотности и располагались в виде крупных или мелких клеточных скоплений на границе с ацинарной тканью. Секреторные гранулы диаметром [439,0 ± 46,4] нм., с электронно плотной сердцевиной располагались преимущественно у полюсов клеток занимая объемную долю в 12,6 %. Часть секреторных гранула не имели электронно плотной сердцевины.

В В-клетках панкреатических островков при стрептозотоцин-индуцированном диабете отмечались определялись единичные в-клетки с конденсацией хроматина ядер, наличием липидных включений в цитоплазме. Происходило незначительное расширение и вакуолизация компонентов гранулярной эндоплазматической сети и комплекса Гольджи, с уменьшением или полным отсутствием секреторных гранул. В большинстве клеток прослеживались явления набухания и частичной деструкции элементов эндоплазматической сети и комплекса Гольджи. В островках также встречались инсулоциты с цитоплазмой низкой и умеренной электронной плотности, расположенные мозаично в пределах островков. Секреторные гранулы располагались полярно у одного из полюсов клетки, их объемная доля составляла 9,1 %, а диаметр [421,5 ± 52,3] нм. В-эндокри-ноциты, имеющие цитоплазму низкой электронной плотности, располагались в виде крупных или мелких скоплений на границе с ацинарной тканью. Секреторные гранулы диаметром [425,1 ± 40,9] нм., были расположены преимущественно у полюсов клеток, занимая объемную долю в 11,9 %. Электронно плотная сердцевина в части секреторных гранула отсутствовала.

У животных с моделью иммунозависимого СД, происходило выраженное уменьшение коли- чества инсулоцитов, в некоторых островках Лангерганса определялись выраженные некротические изменения или разрастание соединительной ткани. Остатки в-эндокриноцитов располагались преимущественно в центральных отделах панкреатических островков в виде мелких групп или единичных клеток. Большинство инсулоцитов имело неправильную форму, резко вакуолизированную цитоплазму с неравномерным распределением в ней органелл. Визуализировались набухшие митохондрии, кариопикноз, фрагменты разрушенной гранулярной эндоплазматической сети и комплекса Гольджи, секреторные гранулы не определялись. В некоторых в-эндокриноцитах в цитоплазме отмечались единичные липидные включения, элементы гранулярной эндоплазматической сети и комплекса Гольджи были резко расширены и вакуолизированы, а ядерный хроматин конденсировался и располагался в периферических отделах ядра. Секреторные гранулы располагались хаотично как вокруг ядра, так и у плазмолеммы неравномерно в виде единичных скоплений. Их электронно-плотная сердцевина становилась более крупной по сравнению с группой интактных животных, а светлый аморфный ободок уменьшался.

В-эндокриноциты без признаков деструкции с цитоплазмой низкой электронной плотности сохраняли развитую гранулярную эндоплазматическую сеть и компоненты комплекса Гольджи. Секреторные гранулы с электронно плотной сердцевиной имели диаметр [435,4 ± 61,2] нм. и располагались преимущественно в периферических отделах цитоплазмы занимая объемную долю в 17 %. Количество эндо-секреторных гранул без электронно плотной сердцевины достоверно возрастало по сравнению с интактной группой.

В инсулоцитах без признаков деструкции с цитоплазмой умеренной электронной плотности гранулярная эндоплазматическая сеть и комплекс Гольджи были представлены разрозненными цистернами и единичными эндосекреторными гранулами без электронно плотной сердцевины. Секреторные гранулы с электронно плотной сердцевиной имели диаметр [302,5 ± 43,4] нм, а их объемная доля составляла 10,3 %.

Ультраструктурные изменения в-клеток при токсическом действии стрептозотоцина и аллоксана характеризуются набуханием и деструкцией комплекса Гольджи и элементов эндоплазматической сети, что сопровождается уменьшением размеров и численности секреторных гранул и развитием необратимых некротических процессов [8, 10]. Однако, возможен и второй путь гибели инсулоцитов островков Лангерганса — апоптоз, который ультрамикроскопически сопровождается конденсацией, маргинацией и фрагментацией хроматина ядер, набухание митохондрий, уплотнение цитоплазмы, формирование апоптоти-ческих телец, что проявляется в значитель- ном уменьшение инсулоцитов и объёмной доли островков [9, 12].

При экспериментальном моделировании диабета необратимые повреждения затрагивают не все В-клетки, часть из них находятся в состоянии гипертрофии с выраженной дегрануляцией и уменьшением объёмной доли секреторных гранул [6, 11].

Известно, что конверсия проинсулина в инсулин происходит в секреторных гранулах комплекса Гольджи. По мере созревания секреторных гранул происходит уменьшение количества проинсулина и увеличение количества инсулина, что морфологически проявляется в появлении в центральных отделах гранулы электроно плотной сердцевины. Зрелые гранулы мигрируют к плазматической мембране, для дальнейшего слияния с ней и выброса инсулина в интерстициальное пространство, межклеточную жидкость и кровеносные капилляры. Таким образом, при увеличении потребности в инсулине в В-эндокриноцитах вначале происходит увеличение количества зрелых гранул и их объемной доли, с преимущественной локализацией на периферии клеток. По мере увеличения секреции инсулина количество зрелых секреторных гранул на периферии клетки уменьшается, а количество гранул без электронно плотной сердцевины в цитоплазме увеличивается.

Увеличение количества незрелых секреторных гранул, большое количество митохондрий характерно для В-клеток с цитоплазмой низкой электронной плотности, что отражает высокую степень их функциональной активности [6, 9].

Таким образом, различия в электронной плотности цитоплазмы В-клеток свидетельствуют о различной степени их функциональной активности. У интактных животных соотношение В-эндокриноци-тов с цитоплазмой низкой и умеренной электронной плотности составляет 1:1, а при экспериментальном моделировании сахарного диабета преобладающим типом клеток оказывается популяция с цитоплазмой низкой электронной плотности [5].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ультрамикроскопические признаки необратимого повреждения В-эндокриноцитов определяются при всех экспериментальных моделях сахарного диабета и представлены изменениями характерными для некроза и апоптоза.

Наиболее выраженные некротические изменения отмечаются при аллоксан-индуцированном и стрептозотоцин-индуцированном диабете. Для иммунозависимого диабета наиболее характерны ультрамикроскопические признаки апоптоза с незначительными некротическими изменениями.

Сохранение типичной компартментализации в части В-клеток панкреатических островков при экспериментальном моделировании диабета отражает активацию репарационных процессов, как реакцию на повреждающее действие цитотоксинов.