Сравнительный анализ биологических эффектов селективного агониста глюкокортикоидного рецептора CPDA на клеточные линии рака молочной железы различных молекулярных подтипов

Глюкокортикоиды (GC) широко используются в клинической практике, в том числе при лечении онкологических заболеваний. В терапии рака молочной железы (РМЖ) GC применяют в качестве адъювантов для расширения терапевтических интервалов и снижения побочных эффектов цитотоксических препаратов. Однако длительное применение GC может вызвать резистентность к противоопухолевым препаратам и способствовать прогрессии и метастазированию РМЖ [1].

Биологические эффекты GC реализуются посредством активации глюкокортикоидного рецептора (рис. 1). Терапевтические эффекты GC реализуются через ДНК-независимую трансрепрессию, приводящую к аресту клеточного цикла и гибели опухолевых клеток. Развитие побочных эффектов опосредовано запуском механизма трансактивации, для которого необходима димеризация GR [2–4]. Селективные агонисты GR, такие как Compound A, блокируют способность рецептора к димеризации и избирательно запускают в клетках механизм трансрепрессии [3–5]. Ранее нами и другими исследователями было показано, что данное соединение проявляет GR-зависимый противоопухолевый эффект in vitro и in vivo на моделях острого лимфобластного лейкоза, рака простаты и др. [4–7].

Цель исследования – изучение антипроли-феративной активности, трансрепрессорного и трансактивационного потенциала селективного агониста глюкокортикоидного рецептора (CpdA) на клеточных моделях РМЖ различных подтипов in vitro в сравнении с дексаметазоном.

Материал и методы

Клеточные культуры. Клеточные линии аденокарциномы человека MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-453 и клетки эпителия молочной железы человека HBL-100 культивировали в стандартной среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержащей 10 % эмбриональную сыворотку телят, пенициллин

(50 ед/мл) и стрептомицин (50 ед/мл) («ПанЭко», Россия) при 37 ° С в атмосфере 5 % СО 2 .

Определение кинетики пролиферации. Клетки (плотность посева 5000 кл/мл) культивировали в течение 10 сут в присутствии CpdA, дексаметазона (Dex) («KRKA», Словения) в концентрациях 0–10 мкМ, или растворителя (0,01 % ДМСО). Подсчет клеток проводили каждые 48 ч с помощью камеры Горяева.

Проточная цитофлуориметрия. Распределение клеток по фазам клеточного цикла после 24 ч обработки 100 мкМ CpdA/Dex исследовали с помощью метода проточной цитофлуориметрии с окраской йодистым пропидием (PI), как описано ранее [7].

Количественная полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Реакцию обратной транскрипции, количественный ПЦР-анализ в режиме реального времени и оценку изменения экспрессии исследуемой мРНК проводили, как описано ранее [8]. Праймеры для амплификации были сконструированы с помощью базы данных Primer-Bank и пакета программ Oligo 6. Последовательности использованных праймеров для RPL27 F: ACCGCTACCCCCG-CAAAGTG, R: CCCGTCGGGCCTTGCGTTTA; INOS F: CGGCCATCACCGTGTTCCCC, R: TGCAGTCGAGTGGTGGTCCA; FKBP51 F : GAATGGTGAGGAAACGCCGAT, R: TGC-CAAGACTAAAGACAAATGGT; CCND1 F: GCTGGAGCCCGTGAAAAAGA, R: CTC-CGCCTCTGGCATTTTG; CCND2 F: CTACCTTCCGCAGTGCTCCTA, R: CCCA-GCCAAGAAACGGTCC; CCND3 F: TACCCGCCATCCATGATCG, R: AGGCAGTC-CACTTCAGTGC; COX2 F: CCGGGTACAATCG-CACTTAT, R: GGCGCTCAGCCATACAG.

Статистическая обработка данных. Все эксперименты выполнены в трех повторах. Средние значения и среднеквадратичные отклонения рассчитывали с помощью пакета программ Microsoft

Рис. 1. Механизмы активации глюкокортикоидного рецептора.

Примечание: GC – глюкокортикоид, GR – глюкокортикоидный рецептор, TF – фактор транскрипции, RE – респонсивный элемент

Рис. 2. Число жизнеспособных клеток на 10-е сут обработки (за 100 % принято число клеток в контрольных лунках). Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (р<0,05)

Рис. 3. Относительное число (%) клеток MCF-7 и MDA-MB-231 в G1-фазе клеточного цикла. Клетки культивировали с Dex, CpdA или растворителем в течение 24 ч. Анализ проводили методом проточной цитофлуориметрии, с окрашиванием PI.

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (р<0,05)

Excel. Для определения статистической значимости выявленных различий использовали парный двухвыборочный t-тест Стьюдента для средних.

Результаты и обсуждение

Для проведения исследования были выбраны 3 клеточные линии РМЖ различных подтипов: MCF-7 (люминальный А), MDA-MB-231 (базальноподобный), MDA-MB-453 (HER2-положительный); а также линия HBL-100 (ER-отрицательные клетки эпителия молочной железы).

Антипролиферативный эффект CpdA на клетки РМЖ. Было показано, что эффекты CpdA и Dex заметно различаются для клеточных линий РМЖ различных подтипов (рис. 2). Эффект CpdA на клетки MDA-MB-231 оказался в два раза сильнее эффекта на клетки люминального подтипа РМЖ, в то время как дексаметазон проявил наиболее выраженное действие на клетки линии MCF-7. Для клеточных линий HER2-положительного подтипа не наблюдается существенных различий в эффектах CpdA и Dex.

Влияние CpdA на клеточный цикл. Известно, что глюкокортикоиды подавляют клеточное деление, вызывая клеточный арест лимфоидных клеток и остеобластов за счет снижения уровня D-циклинов [3, 8]. Нами было показано, что CpdA, наравне с дексаметазоном, тормозит клеточное деление, индуцируя арест клеток линий MCF-7 и MDA-MB-231 в G1-фазе (рис. 3).

Трансрепрессорный и трансактивационный потенциал CpdA. Для оценки запуска трансактивации нами был выбран ген FKBP51 (FK506 Binding Protein 51). Показано, что CpdA, в отличие от классических GC, не проявляет трансактивационного потенциала в клетках MCF-7 и слабо индуцирует транс-активационный механизм в клетках MDA-MB-231. В то же время CpdA индуцирует запуск трансрепрессии на уровне, близком к дексаметазону. Этот эффект более выражен в клетках люминального подтипа РМЖ, чем базальноподобного (рис. 4).

Заключение

CpdA, как и дексаметазон, обладает антипро-лиферативным эффектом на клетки различных подтипов РМЖ, а также подавляет экспрессию

Рис. 4. Влияние Dex и CpdA на экспрессию циклинов (а, б), COX-2 (в) и iNOS (г) в клетках MCF-7 и MDA-MB-231. Клетки инкубировали с Dex, CpdA или растворителем в течение 4 ч. Уровень экспрессии определяли методом ОТ-ПЦР. Количество ПЦР-продуктов нормализовали по количеству ПЦР-продукта рибосомного белка L27 (Rpl27).

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (р<0,05)

генов, CCND1,2 и iNOS в клетках MCF-7. Важно, что эффекты CpdA для клеток различных подтипов РМЖ заметно отличаются: CpdA обладает максимальным антипролиферативным эффектом на клетки базальноподобного подтипа РМЖ. Полученные результаты являются основанием для дальнейшего изучения SEGRA (в частности, CpdA)