Сравнительный анализ филогений симбиотических генов клубеньковых бактерий с использованием метадеревьев

Работа выполнена в рамках проекта РНФ ¹ 14-26-00094П и проводилась с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ.

сферного азота, — nif -гены (контролируют синтез и регуляцию активности фермента нитрогеназы) и fix -гены (разнородная группа генов, вовлеченных в работу нитрогеназного комплекса, в первую очередь в его снабжение электронами и энергией) (3).

У большинства клубеньковых бактерий nod- и nif / fix -гены собраны в группы, расположенные в геноме в виде отдельных кластеров, структура которых варьирует у разных видов. Например, у клубеньковых бактерий люцерны ( Sinorhizobium meliloti и S . medicae ), гороха ( Rhizobium leguminosarum bv. viciae ), клевера ( R. leguminosarum bv. trifolii ), козлятника ( Neorhizobium galegae ) и сои ( Bradyrhizobium japonicum ) основные nod -гены тесно сцеплены, при этом гены nodABC организованы в один оперон (рис. 1). У многих ризобий структурные гены нитрогеназы nifHDK представляют собой один оперон и тесно сцеплены с генами nifEN . Такая организация генов азот-фиксации характерна для представителей Sinorhizobium , R. leguminosarum , N. galegae и Mesorhizobium loti . Однако у B. japonicum дополнительная копия гена nifH расположена вне nifHDK -оперона, а ген nifA — за пределами nif / fix -кластера совместно с nod -генами.

Рис. 1. Расположение симбиотических генов у различных видов клубеньковых бактерий: • — nod -гены, D — nif -гены, ^D — fix -гены, ¹ — fdx -гены, ^ — несимбиотические гены; ген nodN в геноме R . elti (отмечен звездочкой) имеет хромосомную локализацию. Схемы построены по данным секвенирования геномов изучаемых ризобиальных штаммов (4-11).

У эволюционно продвинутых видов клубеньковых бактерий (например, R. leguminosarum ) симбиотические гены расположены на высокомолекулярных плазмидах (12). В то же время их хромосомная локализация характерна для анцестральной формы — B. japonicum, а также для M. loti (13, 14). Есть ризобии, у которых на хромосоме могут располагаться только некоторые симбиотические гены. Это свойственно, например, для R. etli : большинство симбиотических генов находятся на плазмиде, а ген nodN — на хромосоме (15) (см. рис. 1).

Долгое время молекулярные механизмы эволюции бобово-ризоби-ального симбиоза, насчитывающей 60-70 млн лет (16), оставались неясными. Лишь благодаря методам высокопроизводительного секвенирования, когда началось быстрое накопление данных о составе и строении геномов различных видов бактерий, пангеномному и метагеномному анализу удалось реконструировать тот длинный путь, который прошли микро- и макросимбионты от рекрутирования в бактериальные клетки генов азотфиксации ( nif- генов) до развития современных высокоспециализированных бобово-996

ризобиальных симбиотических систем. Этот процесс, по-видимому, происходил в несколько этапов, на которых рассматриваемые группы генов были приобретены из разных источников: nif -гены и большинство fix -генов — получены анцестральными медленнорастущими ризобиями ( Bradyrhizobium ) от своих свободноживущих предков ( Rhodopseudomonas ) посредством вертикального наследования, тогда как гены синтеза липо-хито-олигосахаридных Nod-факторов, отвечающих за образование клубеньков ( nod -гены), — приобретены от грибов либо от грамположительных бактерий при горизонтальном переносе (17). Возникшие позднее быстрорастущие ризобии ( Rhizobium, Sinorhizobium, Neorhizobium ) получили nod - и nif / fix -гены от анцестральных ризобий при горизонтальном переносе генов (ГПГ), что привело к образованию особых плазмид (p Sym ), содержащих обе группы sym -генов.

Связь филогении sym -генов с механизмами их происхождения и эволюции, а также с локализацией в геномах ризобий исследована недостаточно. Для ее изучения мы использовали новый метод филогенетического анализа с построением «метадеревьев» — комбинированных дендрограмм, на которых относительное положение двух деревьев служит мерой конгруэнтности филогений индивидуальных генов. Ранее этот метод был разработан и использован для анализа альтернативных филогений, полученных при изучении функционально разнородных генов в различных группах эукариот (дрожжи, рыбы), в которых ГПГ ограничен (18).

В нашем исследовании названный метод был применен для филогенетического анализа двух функционально различающихся групп генов ( nod и nif / fix ), которые имеют неодинаковое происхождение и распространялись среди таксономически неродственных групп ризобий посредством как вертикального наследования, так и ГПГ. Выявленные нами особенности топологий филогений, построенных для генов образования клубеньков и симбиотической азотфиксации, позволяют существенно дополнить возникшие ранее представления о направлениях и механизмах эволюции генных систем симбиоза у клубеньковых бактерий.

Целью работы было использование метадеревьев для анализа участия горизонтального переноса в процессе эволюционной сборки кластера симбиотических генов у ризобий.

Методика . Для анализа использовали нуклеотидные последовательности симбиотических генов из полногеномных сиквенсов 9 представителей клубеньковых бактерий: R. leguminosarum bv. viciae 3841 (GenBank GI:115259115) (4), R. leguminosarum bv. trifolii WSM2304 (GI:209537694) (5), S. meliloti 1021 (GI:25168258) (6), S. medicae WSM419 (GI:150031715) (7), B. ja-ponicum USDA110 (GI:47118316) (8), M. loti MAFF303099 (GI:47118328) (9), R. etli CFN42 (GI:89213252) (10), а также N. galegae bv. officinalis HA-MBI1141 (GI:659665307) и N. galegae bv. orientalis HAMBI540 (GI:659657635) (11).

Кластерный анализ выполняли в компьютерной программе MEGA 5.1 . Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью алгоритма ClustalW; математическая модель при составлении древ для каждого исследуемого гена — p-distance, механизм кластеризации — Neighbor-Joining. Численное выражение сходств топологий филогенетических деревьев рассчитывали с применением статистических подходов (реализованы в программе, представленной на сайте (19). Для построения метадерева и анализа достоверности кластеризации использовали коэффициенты различия, которые вычисляли как разность единицы (100 %, уменьшаемое) и соответствующего коэффициента сходства (вычитаемое).

Результаты. На начальном этапе работы были построены филоге- нетические деревья для каждого из следующих 18 генов: генов вирулентности nodA, nodB, nodC (отвечают за синтез коровой части Nod-фактора) (20-22), nodD (при наличии нескольких копий nodD1 это конститутивно экспрессируемый ген флавоноид-чувствительного активатора транскрипции nod-генов) (23), nodI, nodJ (гены мембранных транспортеров Nod-фактора) (24), nodN (кодирует фермент дегидратазу) (25); генов симбиотической азотфиксации fixA, fixB, fixC (компоненты электронно-транспортной цепи нитрогеназы) (26), nifA (ген транскрипционного регулятора nif-генов), nifB, nifN, nifE (отвечают за синтез Fe-Mo кофактора нитрогеназы), nifD, nifH, nifK (структурные компоненты нитрогеназы) (27), fdxN (ферредоксин). Выбор был обусловлен тем, что гомологи указанных генов присутствуют у всех представителей клубеньковых бактерий, отобранных для анализа. Кроме того, в исследование включили традиционный хромосомный таксономический маркер — ген 16S рРНК в связи с консервативностью его нуклеотидной последовательности и низкой частотой горизонтального переноса.

Методология сравнения топологий основана на представлении о том, что горизонтальный перенос генов от одного вида ризобий к другому в ходе эволюции вносит существенные различия в топологии филогений этих генов. В том случае, когда топология деревьев двух генов не различается, предполагают, что они либо не участвуют в горизонтальном переносе совсем, либо переносятся совместно (рис. 2, А).

A

Rhizobium etli

Sinorhizobium medicae

Sinorhizobium meliloti

Rhizobiutn leguminosarum bv. viciae

Neorhizobium galegae bv. officinalis

Neorhizobium galegae bv. orientalis

Mesorhizobium loti

Bradyrhizobium japonicum

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii

Б

Mesorhizobium loti

Rhizobium etli

Sinorhizobium medicae

Sinorhizobium meliloti

Rhizobium leguminosarum bv. viciae

Neorhizobium galegae bv. officinalis

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii

Bradyrhizobium japonicum

Neorhizobium galegae bv. orientalis

Рис. 2. Сравнения топологии филогенетических деревьев для генов nifH (слева) и nifN (справа) со степенью сходства 100 % (А) и для генов fdxN (слева) и 16S рРНК (справа) со степенью сходства 50,5 % (Б) . Стрелкой отмечено наиболее заметное различие в топологии: перемещение Rhizobium etli из кластера R. leguminosarum на древе гена 16S рРНК в кластер M. loti на древе fdxN .

В то же время несоответствие в топологии деревьев, построенных на основании анализа сиквенсов одного и того же набора штаммов, представляет собой следствие горизонтального переноса симбиотических генов (см. рис. 2, Б). По этим различиям в топологии мы можем предполагать, как происходил ГПГ в ходе эволюции. Например, видно, что в древе по гену 16S рРНК в одном кластере находятся два биовара R. leguminosarum и R. etli . Так как ген 16S рРНК — хромосомный маркер, то допустимо утвер-998

ждать, что кластеризующиеся вместе представители эволюционно близки. В то же время на древе плазмидного маркера fdxN ризобии R. etli группировались в одном кластере с M. loti, хотя R. etli и M. loti относятся к разным семействам — Rhizobiaceae и Phyllobacteriaceae. Этот факт позволяет предположить, что имел место горизонтальный перенос гена fdxN между клубеньковыми бактериями M. loti и R. etli либо при горизонтальном переносе указанные виды получили этот ген из одного источника.

Рис. 3. Основные кластеры метадерева по матрице сходств топологий в филогенетических деревьях, построенных по данным о нуклеотидном полиморфизме симбиотических генов: 1 — nif/fix- кластер, 2 — nod- кластер.

Затем мы сравнили все полученные 19 филогенетических деревьев для выявления различий в их топологиях. Би-оинформатический анализ полученных данных позволил рассчитать коэффициенты попарного сходства топологий для всех деревьев, варьирующие от 1 (полная конгруэнтность двух филогений) до 0 (полное отсутствие конгруэнтности). Затем построенная матрица сходств была преобразована в матрицу различий вычитанием соответствующих коэффициентов сходства из единицы. По данным этой матрицы было построено метадерево (рис. 3).

Видно, что в метадере- ве достоверно выделились два кластера: группа nif/fix-генов оказалась пре- имущественно сосредоточена в кластере 1, nod-генов — в кластере 2, тогда как хромосомный маркер (ген 16S рРНК) не вошел ни в один из кластеров (табл.).

Оценка достоверности кластеризации метадерева в соответствии со средним расстоянием внутри и между кластерами / группами генов с использованием t -критерия Стьюдента

Группа сравнения	TD	SD	SE	Достоверность различий по t -критерию Стьюдента при уровне значимости p
Внутри кластера 1	0,197	0,094	0,013	< 0,001
Внутри кластера 2	0,216	0,104	0,020	< 0,01
Между кластерами	0,269	0,107	0,012
Внутри группы nif-fix	0,194	0,084	0,011	< 0,001
Внутри группы nod	0,201	0,082	0,018	< 0,01
Между группами симбиотических генов	0,270	0,099	0,011

П р и м е ч а н и е. TD — среднее различие топологий, SD — стандартное отклонение, SE — стандартная ошибка. Проводили сравнение среднего расстояния между топологиями деревьев внутри одного класте-ра/группы, а также между деревьями одного кластера/группы и каждым деревом другого кластера/группы. Структура кластеров приведена на рисунке 3.

Такая кластеризация может указывать на то, что в эволюционной истории группы генов nod и nif/fix не связаны между собой и с хромосомными генами. Она определяется их самостоятельным происхождением и раздельным горизонтальным переносом. Действительно, различие групп nod- и nif/fix-генов выражено не менее четко, чем несходство между кластерами 1 и 2. Однако были выявлены и исключения: ген nodI, который находится в nif/fix кластере 1 и переносится вместе с геном nifD, а также гены nifB и fixC, попадающие в nod-кластер 2 вместе с nodA.

Как отмечалось выше, в геномах многих клубеньковых бактерий симбиотические гены объединены в кластеры. В связи с этим совместный горизонтальный перенос групп nod - и nif / fix генов может быть обусловлен особенностями их кластерного расположения в геноме (см. рис. 1). Тем не менее, объяснить полученную картину только спецификой расположения генов на генетических картах не представляется возможным. Так, в кластере 1 были обнаружены все структурные гены нитрогеназы, причем гены nifH , nifK , nifE и nifN группировались друг с другом. Подобная кластеризация генов соответствует их расположению в геномах, поскольку у всех изучаемых организмов гены nifHDK составляют один оперон, к которому прилегают гены nifE и nifN . Единственное исключение — локализация гена nifN за пределами nif / fix -региона у клубеньковых бактерий люцерны ( Sinorhizobium meliloti ). Вместе с теми же nod -генами в кластере 2 был обнаружен nodN , однако внутри кластера он располагался отдельно. Следует отметить, что локализация nodN в геноме может быть различной. У некоторых представителей он находится в одном кластере с генами nodABC ( S. meliloti , S. medicae , R. leguminosarum ), у других — расположен отдельно от общих nod -генов. Например, у R. galegae nodN находится в другом nod -кластере, а у B. japonicum, M. loti и R. etli — вообще вне кластера симбиотических генов. Кроме того, у R. etli ген nodN имеет хромосомную локализацию.

Интересным результатом анализа стало попадание генов nifB и fixC в кластер 2 и их группировка вместе с геном nodA . В настоящее время известно, что гены, отвечающие за синтез корового Nod-фактора ( nodABC ), имеют неризобиальное происхождение. Так, A. Hirch с соавт. (28) проанализировали последовательности бактериальных и грибных генов, кодирующих ферменты с каталитическими центрами, схожими с таковыми у продуктов генов nodABC . Было сделано предположение, что гены nodB и nodC могли быть получены ризобиями в процессе горизонтального переноса от грамположительных бактерий, у которых они участвуют в биогенезе муреиновой клеточной стенки. Кроме этого указанные гены могли быть получены клубеньковыми бактериями от грибов, активно синтезирующих хитиноподобные вещества. Известно, что многие грибы вступают с бактериями в тесные симбиотические отношения, при которых вполне возможен горизонтальный перенос генов. Однако для гена nodA гомологичных последовательностей в других организмах не обнаружили. Таким образом, ген nodA имеет иное происхождение, нежели nodB и nodC (28). В связи с этим его кластеризация вместе с генами nifB и fixC может свидетельствовать об их изначально совместном горизонтальном переносе из не идентифицированных пока организмов.

Важно отметить, что на специфику кластеризации генов на метадереве, несомненно, должно влиять не только их расположение у современных форм ризобий, но и происходившие ранее эволюционные события, включая независимые перестройки геномов (см. рис. 1), причем свою локализацию могли изменять как отдельные гены, так и содержащие их участки генома. В качестве примера таких перестроек можно привести инверсию nif / fix региона у N. galegae bv. orientalis (18) и транслокацию генов nifHDKEN у R. leguminosarum bv. viciae (11). Несомненно, что геномные перестройки оказывают существенное воздействие на порядок кластеризации генов, однако степень их влияния в рамках примененной модели недостаточно ясна. Существенную роль в возникновении различий в топологиях двух генов, вероятно, играет и неодинаковая скорость их эволюции.

Полученные в нашем исследовании результаты не согласуются с данными, полученными методами молекулярной филогении. Ранее было показано, что полиморфизм nod-генов сформировался независимо от дивергенции коровых элементов бактериального генома, однако коррелирует с таксономией хозяев, тогда как полиморфизм nif-генов коррелирует с дивергенцией коровой части генома бактерий, но не связан с дивергенцией хозяев (29). В нашем исследовании метод метадеревьев показал независимость эволюционной истории как nod-, так и nif/fix-генов от хромосомного маркера (ген 16S рРНК). Возможно, использованный нами метод чувствительнее к влиянию эволюционных факторов, не связанных с ГПГ и не учитываемых в традиционных филогенетических подходах.

Таким образом, результаты филогенетического анализа nod- и nif / fix -генов, который мы провели с помощью метода построения и анализа метадеревьев, подтверждают выявленные ранее различия в эволюционных историях этих генов. Обнаружение двух кластеров, один из которых состоит преимущественно из nif / fix -генов (кластер 1), другой — из nod- генов (кластер 2), может отражать тот факт, что сопоставляемые группы генов возникли на разных этапах эволюции ризобий (в связи с чем они занимают различные участки на хромосомах или плазмидах ризобий), а также экспрессию этих генов на разных стадиях развития симбиоза (инфицирование корневых волосков и освобождение в растительную цитоплазму для nod- генов, симбиотическая фиксация азота — для nif / fix -генов). Присутствие некоторых nod- генов в кластере 1 и некоторых nif / fix -генов — в кластере 2, возможно, обусловлено тем, что на поздних этапах эволюции ризобий весь комплекс sym -генов переносился как единое целое в составе Sym -плазмид или геномных островов. Нельзя также исключить, что отсутствие корреляции между структурой кластеров, выявленных при анализе метадерева, и расположением изучаемых генов на генетических картах — следствие интенсивных внутригеномных перестроек, характерных для многих ризобий, и разной скорости эволюции первичной структуры у изучаемых генов.

Дальнейший анализ роли указанных эволюционных механизмов требует модификации использованного нами подхода, в частности раздельного анализа структур метадеревьев, построенных с использованием выборок штаммов, возникших на ранних стадиях эволюции ризобий (когда ГПГ был ограничен в связи с хромосомной локализацией sym -генов у Bradyrhizobium ) либо на поздних стадиях (когда ГПГ был наиболее интенсивен и скорее всего захватывал весь комплекс sym -генов, локализованных на плазмидах Rhizobium и Sinorhizobium ). Важная задача усовершенствования использованного метода состоит также в разработке статистических и биоинформационных критериев поддержки кластеров, выявляемых на метадеревьях, поскольку на первом этапе работы мы применили для решения этой задачи лишь стандартные биометрические подходы.

Итак, филогенетический анализ nod- и nif/fix-генов, проведенный нами с помощью построения и сопоставления метадеревьев, подтвердил выявленные ранее различия в эволюционных историях этих генов. Наличие двух кластеров в метадереве, один из которых объединяет преимущественно nif/fix-, другой — nod-гены, может быть связано с тем, что этапы эволюции ризобий, на которых возникли сопоставляемые группы, не совпадали, а также с экспрессией этих генов на разных стадиях развития симбиоза. Отсутствие корреляции между структурой кластеров в метадереве и результатами генетического картирования, возможно, обусловлено внутригеномными перестройками и неодинаковой скоростью эволюции нуклеотидных последовательностей генов. Для усовершенствования примененного метода необходимо разработать статистические и биоинформа- ционные критерии поддержки кластеров, выявляемых на метадеревьях.