Сравнительный анализ экспрессии генов и накопления БТШ70 у представителей двух разных популяций байкальского вида Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf., 1858)

Одним из актуальных научных направлений в биологии является изучение адаптаций живых организмов к условиям окружающей среды. Важную роль в процессе адаптации к различным факторам играют белки теплового шока (БТШ). Гены белков теплового шока (бтш) и синтез их продуктов индуцируются не только теплом, но и рядом других повреждающих факторов физического и химического происхождения (ультрафиолетом, тяжелыми металлами и др.) Наиболее консервативны гены бтш70. Аминокислотные последовательности БТШ70 у человека и E. сoli гомологичны на 50%, а ряд доменов – на 96% (Schlesinger, 1990). Такой консерватизм БТШ у всех изученных организмов свидетельствует об исключительно важной роли этих белков в защите клеток от повреждений во время и после стресса и указывает на важную роль этих белков в процессе адаптации.

Изучение роли БТШ70 в молекулярных механизмах адаптации на организменном уровне, а также на уровне популяций представляет интерес с точки зрения эволюции в целом и видообразования в частности.

Ранее, у нескольких видов ящериц, обитающих в разных температурных условиях, были найдены популяционные различия на уровне синтеза БТШ70 (Ulmasov ., 1992).

Одним из наиболее перспективных объектов исследования фенотипической пластичности стресс-ответа являются эндемичные обитатели озера Байкал. Самые многочисленные представители фауны озера Байкал амфиподы, представленные в озере 350 видами и подвидами. Амфиподы озера представляют собой универсальную модельную систему для изучения механизмов адаптации к меняющимся условиям среды.

Проведенные ранее исследования показали различия в механизмах экспрессии и синтеза БТШ70 в реакции на стрессовое воздействие у ряда байкальских амфипод (Тимофеев, 2010, Bedulina et al ., 2013). Однако исследований вариабельности стресс-ответа у разных популяций одного вида, до этого не проводили.

Целью данной работы явилась оценка влияния градиентного повышения температуры на экспрессию генов и накопление БТШ70 у представителей удаленных популяций эндемичного вида байкальских амфипод.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом настоящего исследования были выбраны амфиподы вида Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf., 1858). E. verrucosus - типичный обитатель литорали, встречается повсеместно под камнями, начиная с глубины в несколько сантиметров вплоть до 10 - 15 метров. Из ранее опубликованных материалов известно, что E. verrucosus холодолюбивый вид, предпочитающий температуру 5-6 °С, с диапазоном метаболической стабильности от 4 до 11 0С (Аксенов-Грибанов и др., 2013) Исследуемые популяции вида достаточно удалены друг от друга, находятся на разных широтах (Северобайкальск 109.313409,55.625964, Большие Коты 105.074681,51.904787), температура в литоральной зоне этих мест отличается. (Ладейщиков 1982).

В исследованиях использовали амфипод собранных в пос. Большие Коты (Южный Байкал - южная попуряция) и в прибрежной зоне г. Северобайкальск (Северный Байкал - северная популяция). Предварительно акклимированных амфипод экспонировали в аэрируемыхых аквариумах (объем 1,5-2 литра), помещенных в термостат при постепенном градиентном повышении температуры со скоростью 1 ˚С в час. Каждые 4 часа (при температурах 10 ˚С, 14 ˚С, 18 ˚С и 22 ˚С) фиксировали рачков для последующих молекулярно-биохимических анализов. Непосредственно перед началом и в ходе эксперимента часть особей, не подверженных температурному воздействию, была зафиксирована в качестве контроля. Работы проводили в ходе одного сезона (июль 2012 г).

Для выделения РНК использовали животных весом от 200 до 500 мг, которых гомогенизировали с использованием 0,5-1 мл Qiazol Reagent (Qiagen, USA) в гомогенизаторе

MM400 (Retsch, Germany). К смеси добавляли 200 мкл хлороформа, аккуратно перемешивали и центрифугировали. Верхнюю фазу переносилили на MaXtract гель (Qiagen, USA), для лучшего отделения РНК от геномной ДНК по прилагаемому к MaXtract гелю протоколу. Далее из водной фазы была изолирована РНК согласно протоколу для miRNeasy набору с добавочным шагом, который удаляет ДНКазы из смеси (Qiagen, USA). РНК элюировали с колонок 30 мкл воды.

Для обратной транскрипции использовали 5 мкг РНК, на которой синтезировали кДНК, с использованием Oligo(dT)18 праймера (Fermentas, USA, #SO131) и обратной транскриптазы H Minus Reverse Transcriptase (Fermentas, USA, #EP0452) по инструкции фирмы производителя.

Экспрессию гена бтш70 оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на приборе StepOnePlus (Applied Biosystems). Реакцию проводили в объеме 12.5 мкл с использованием набора SensiMix SYBR Low-ROX (Bioline) с финальной концентрацией 3 мМ MgCl 2 и 250 нМ каждого праймера. Для амплификации гена-мишени ( бтш70 ) и референтных генов ( β-actin, gapdh, Ef1a ) использовали специфичные праймеры: для гена β-actin прямой – GCTGCGGTGTTCATCTCATTCTC, обратный TTCGTCTGGACTTGGCTGGTC; для гена gapdh прямой – TTGCCGCCCTCAGCCTTG, обратный – CTCAGGTGGTCGCCGTCAAC; для гена Ef1a прямой – CTCGGTGCTGTCCATCTTGTTG, обратный – GGCTGATTGTGCTGTGCTGATC; для гена hsp70 прямой – CCAAGATGAAGGAGACTGCTGATG, обратный – CGCCGTGGGTTCGTTGATAATC. Количественная ПЦР проводилась при следующих условиях: 94 °C

4 мин; 35 циклов 95 °C 20 сек, 60 °C 20 сек и 72 °C

20 сек. Экспрессию гена бтш70 измеряли методом сравнения параметра относительной экспрессии ΔΔCt (Vandesompele et al ., 2002).

Для определения содержания БТШ70 проводили денатурирующий электрофорез с последующим вестерн-блоттингом. Вестерн-блоттинг осуществляли методом полусухого переноса на PVDF мембрану (GE Healthcare, UK) (Towbin., 1979). Мембраны по очереди выдерживали от 30 мин. до 1 часа в растворе моноклональных антител к БТШ70 (Sigma-Aldrich, # H5147, разведение 1:5000) и 4 часа в растворе вторичных антител коньюгированных с щелочной фосфотазой (antimouse IgG:AP Conj., Stressgen # SAB-101, разведение 1:1000). Для определения актина использовали антитела (Sigma-Aldrich, # A2668, разведение 1:1000) и вторичные антитела (Sigma, # A9919, разведение 1:1000) с последующей цветной реакцией с 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфатом (BCIP) и нитроголубым тетразолием (NBT), осуществляемой щелочной фосфатазой, с образованием темно-синей окраски. Обработанные таким образом мембраны отмывали дистиллированной водой, высушивали, сканировали и подвергали денситометрическому анализу при помощи программы ImageJ (Ferreira, Rasband, 2012,. Уровень БТШ70 в каждом образце был нормализован по актину.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рисунке 1А представлены результаты оценки экспрессии гена бтш70 у особей не подвергшихся воздействию постепенного повышения температуры. Видно, что уровень экспрессии генов у представителей обеих популяций одинаков.

При градиентном повышении температуры среды достоверных отличий в уровне экспрессии генов у представителей северной популяции обнаружено не было, о чем свидетельствуют данные представленные на рисунке 1Б.

Иную картину можно наблюдать у представителей южной популяции. На рисунке 1Б можно увидеть, что при достижении температуры 14 ⁰С уровень экспрессии бтш70 достоверно отличается от начальных значений

При оценке базальных уровней БТШ70 были обнаружены выраженые межпопуляционные различия. Как видно из рисунка 2А базальный уровень БТШ70 у особей южной популяции вида выше, чем у особей северной популяции.

При измерении уровня БТШ70 в ходе эксперимента на постепенное повышение температуры также были обнаружены различия между представителями обеих популяций.

Показано, что у представителей северной популяции вида при достижении температуры 10 0С уровень БТШ70 статистически достоверно отличается от начальных значений. У представителей южной популяции достоверных отличий от начальных значений не было.

Полученные нами данные о различие в базальном уровне содержании БТШ70 у представителей двух популяций E. verrucosus соотносятся с литературными данными.

Так ранее рядом работ показана связь между температурными условиями обитания животных и БТШ70 (Hofman, 2005). У южных видов пустынных ящериц при нормальных условиях наблюдалась повышенная экспрессия генов бтш70 , нежели у северных видов (Зацепина, 2009). Подобные работы также были произведены на моллюсках (Sagarin and Somero, 2006; Dutton, Hoffman, 2009; Dong et al ., 2008), дрозофилах (Garbuz et al ., 2002), лягушках (Ulmasov et al ., 1992) и других организмах.

Рисунок 1. Экспрессия гена бтш70 E. verrucosus . А – контроль, Б – при градиентном повышении температуры среды на 1 °С в час у представителей южной популяции (Большие Коты), В - при градиентном повышении температуры среды на 1 °С у представителей северной популяции (Северобайкальск). RQ – относительный уровень экспрессии генов. * - статистически достоверное отклонение от контроля при P<0,05

Рисунок 2. Уровень белка БТШ70 E. verrucosus А – в базальный уровень БТШ70, Б - при градиентном повышении температуры среды на 1 °С у представителей северной популяции (Северобайкальск), в - при градиентном повышении температуры среды на 1 °С у представителей южной популяции (Большие Коты). * - статистически достоверное отклонение от контроля при P<0,05

Можно заключить, что базальный уровень белка и характер динамики экспрессии генов бтш70 отличался у рачков обеих исследованных популяций. Показанные различия свидетельствуют о наличии внутривидовой фенотипической пластичности стресс-ответа у E. verrucosus.

Авторский коллектив выражает благодарность к.б.н. Протопоповой М.В. за дизайн праймеров и отработку метода. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ (12-04-31767 мол_а, 12-04-90039 Бел_а, 12-04-98062-р_сибирь_а, 11-04-91321-СИГ_а), грантов Президента РФ МК-5466.2012.4, МД-2063.2012.4, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной

России», а также программы стратегического развития ИГУ.